Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode
Summary
Kapillar isoelektrisk fokusering er en antistof-baseret, ultrasensitive, høje overførselshastighed teknik, muliggør detaljeret karakterisering af proteiner og deres isoformer fra ekstremt lille biologiske prøver. I det følgende beskrives en protokol til påvisning og kvantificering af specifikke proteiner og deres isoformer i en automatiseret og robotiserede måde.
Abstract
Immunoblotting er blevet en rutinemæssig teknik i mange laboratorier til protein karakterisering af biologiske prøver. Følgende protokol giver en alternativ strategi, kapillær isoelektrisk fokusering (cIEF), med mange fordele i forhold til konventionelle immunoblotting. Dette er en antistof-baseret, automatiseret, hurtig og kvantitativ metode, hvor en komplet western blotting procedure finder sted inde i en ultratynde kapillær. Denne teknik kræver en gel til at overføre til en membran, stripning af klatter, eller x-ray film, der er typisk kræves til konventionelle immunoblotting. Her, proteiner er adskilt i henhold til deres charge (isoelektriske punkt, pI), bruger mindre end en microliter (400 nL) af total protein lysate. Efter elektroforese, proteiner er immobiliseret på de kapillar vægge af ultraviolet lys behandling, efterfulgt af primære og sekundære (peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret) antistof inkubation, hvis bindende opdages gennem forbedret kemiluminescens (ECL), generere et lyssignal, som kan være fanget og optaget af et kamera, charge – sammen enhed (CCD). Det digitale billede kan analyseres og kvantificeret (toparealet) ved hjælp af software. Denne høje overførselshastighed procedure kan håndtere 96 prøver ad gangen; er meget følsomme, med protein påvisning i pikogram-området; og producerer meget reproducerbare resultater på grund af automatisering. Alle disse aspekter er meget værdifulde, når antallet af prøver (f.eks., vævsprøver og biopsier) er en begrænsende faktor. Teknikken har bredere applikationer samt, herunder screening af narkotika eller antistoffer, biomarkør opdagelse og diagnosticering.
Introduction
Kapillar isoelektrisk fokusering (cIEF) er en automatiseret, kapillær-baseret immunassay, der løser proteiner på grundlag af deres afgift1,2,3. Det er meget reproducerbare og i stand til at løse proteiner og deres post-translationally modificerede isoformer hurtigt og kvantitativt. Det præsenterer en alternativ til konventionelle metoder såsom western blotting. Mens western blotting er meget godt for at bekræfte tilstedeværelsen af rigelige proteiner i lettilgængelig prøver; variation, tidsforbrug og nøjagtig kvantificering alle nuværende udfordringer, især ved behandlingen af biologiske vævsprøver. Faktisk variation er en iboende problem i western blotting, da der er mange trin involveret, såsom lastning og drift af SDS-PAGE geler, overførsel af proteiner på membranen, inkubation med forskellige reagenser (fx., primære og sekundære antistoffer, ECL), og udvikling op på X-ray film4. I øjeblikket er at forbedre den western blotting teknik med gennemførelsen af digital optagelse af kemiluminescerende signaler (digital westerns). For nylig, en automatiseret western blotting system er blevet udviklet, nemlig den kapillar vestlige, som er en mere hænder-omkostningsfrit og gel-fri system. Hele analysen er automatiseret efter indlæsning af en prøve plade (prøver med alle nødvendige reagenser) ind i systemet3,4. Instrumentet vil udføre alle trinene såsom protein adskillelse, immobilisering af proteiner på kapillar væggen, antistof inkubationer, vasker mellem forskellige trin, og udvikling og kvantificering af kemiluminescens-signaler. Således giver cIEF proceduren præsenteres her højere opløsning og følsomhed.
Denne metode er følsomme, som signaler kan genereres og kvantificeres fra picogram proteiner1. Den høje følsomhed med fremragende reproducerbarhed gør denne teknologi meget nyttigt til analyse af kliniske prøver. Det kan detektere samt skelne post translationel ændring (f.eks. forskellige fosforyleres protein isoformer) af proteiner. Denne teknologi held har været anvendt til at dissekere forskellige signaling veje4,5 i kliniske undersøgelser med henblik på at udvikle nye therapeutics i kræft3, og det har stort potentiale for protein biomarkør og drug discovery .
Protocol
Representative Results
Discussion
Følsomhed og opløsning af proteiner er afgørende for proteom forskning på biologiske prøver. Der er stor værdi i at være i stand til at opdage proteiner, som findes i små mængder i celler. cIEF kan tilbyde bedre følsomhed og opløsning til påvisning af proteiner og deres isoformer4.
Denne teknologi har held været anvendt i mange proteom forskning rapporter5,6,7. Sta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren tak Prof. Lena Claesson-walisisk, Uppsala Universitet, Sverige for hendes støtte til udvikling af dette projekt. Derudover tak forfatteren Ross Smith og Lena Claesson-walisisk, Uppsala Universitet for deres kritisk læsning og forslag til at forbedre håndskriftet.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Riferimenti
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
