Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode
Summary
La focalisation isoélectrique capillaire est une technique de base d’anticorps, ultrasensible, haut débit, ce qui permet une caractérisation détaillée de protéines et leurs isoformes de très petits échantillons biologiques. Ce qui suit décrit un protocole pour la détection et la quantification des protéines spécifiques et leurs isoformes de manière automatisée et robotisée.
Abstract
Immunoblotting est devenue une technique courante dans de nombreux laboratoires pour la caractérisation de protéines provenant d’échantillons biologiques. Le protocole suivant fournit une autre stratégie, capillaire isoélectrique en se concentrant (cIEF), avec de nombreux avantages comparé à conventionnel immunoblotting. Il s’agit d’une méthode axée sur les anticorps, automatisée, rapide et quantitative, dans lequel une procédure complète de transfert occidentale se déroule à l’intérieur d’un tube capillaire ultramince. Cette technique ne nécessite un gel de transférer à une membrane, décapage des taches, ni aux rayons x des films qui sont habituellement requis pour immunoblotting classique. Ici, les protéines sont séparées selon leur charge (point isoélectrique ; pI), à l’aide de moins d’un microlitre (400 nL) de lysat de protéine total. Après électrophorèse, les protéines sont immobilisés sur la paroi des capillaires de traitement par la lumière ultraviolette, suivie de primaire et secondaire (peroxydase de raifort (HRP) conjuguée) amélioré d’incubation d’anticorps, dont liaison détectée par le biais chimiluminescence (ECL), générant un signal lumineux qui peut être capturé et enregistré par une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD). L’image numérique peut être analysé et quantifié (aire du PIC) à l’aide de logiciels. Cette procédure de haut débit peut gérer 96 échantillons à la fois. est très sensible, avec détection de protéines dans la gamme picogramme ; et produit des résultats hautement reproductible en raison de l’automatisation. Tous ces aspects sont extrêmement précieuses lorsque la quantité d’échantillons (par exemple, des échantillons de tissus et biopsies) est un facteur limitant. La technique a des applications plus larges, y compris le dépistage des drogues ou des anticorps, découverte de biomarqueurs et des fins de diagnostic.
Introduction
Isoélectrofocalisation capillaire (cIEF) est un test immunologique automatisé, axée sur les capillaires qui résout des protéines sur la base de leurs frais1,2,3. Il est hautement reproductible et capable de résoudre les protéines et leurs isoformes modifiées post-traductionnellement rapidement et quantitativement. Il présente une alternative aux méthodes classiques comme le western blot. Alors que le western blot est très bon pour confirmer la présence de protéines abondantes dans les échantillons facilement accessibles ; variabilité, consommation de temps et dosage précis tous présents défis, en particulier lors de l’examen des échantillons de tissus biologiques. En effet, la variabilité est un problème inhérent à éponger occidental, qu’il y a nombreuses étapes, telles que le chargement et fonctionnement des gels SDS-PAGE, transfert des protéines sur membrane, incubation avec différents réactifs (e.g., primaire et secondaire anticorps, ECL) et le développement sur x-ray film4. Actuellement, la technique western blot s’améliore avec la mise en œuvre de l’enregistrement numérique des signaux par chimiluminescence (Western digital). Récemment, un système automatisé de transfert western a été développé, à savoir le capillaire Ouest, qui est un système plus les mains libres et sans gel. Le test complet est automatique après le chargement d’une plaque d’échantillon (échantillons avec tous les réactifs nécessaires) dans le système3,4. L’instrument se produira toutes les étapes telles que la séparation de protéines, immobilisation des protéines sur la paroi capillaire, des incubations anticorps, lave entre les différentes étapes, de développement et quantification des signaux par chimiluminescence. Ainsi, la procédure de cIEF présentée ici fournit plus haut résolution et sensibilité.
Cette méthode est sensible, comme les signaux peuvent être générés et quantifiés de picogrammes de protéines1. La haute sensibilité avec excellente reproductibilité rend cette technologie très utile pour l’analyse des échantillons cliniques. Il peut détecter ainsi distinguer post traductionnelle modification (par exemple, les isoformes de protéines phosphorylées différents) des protéines. Cette technologie a été utilisée avec succès pour disséquer les différents signalisation voies4,5 études cliniques visant à développer de nouvelles thérapeutiques dans le cancer3, et il a un grand potentiel pour la protéine biomarqueur et découverte de médicaments .
Protocol
Representative Results
Discussion
Sensibilité et la résolution des protéines sont cruciales pour la recherche protéomique sur des échantillons biologiques. Il est une grande valeur à pouvoir détecter les protéines qui sont présentes en quantités infimes dans les cellules. cIEF peut offrir une sensibilité améliorée et la résolution pour la détection des protéines et leurs isoformes4.
Cette technologie a été utilisée avec succès dans plusieurs protéomiques recherche rapports<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur remercie le Prof. Lena Claesson-Welsh, Université d’Uppsala, en Suède, pour son soutien pour l’élaboration de ce projet. En outre, l’auteur remercie Ross Smith et Lena Claesson-Welsh, Université d’Uppsala pour leur lecture critique et des suggestions pour améliorer le manuscrit.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Riferimenti
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