Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode
Summary
Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.
Abstract
Immunoblotting ist eine routinemäßige Technik in vielen Laboratorien zur Charakterisierung von Protein aus biologischen Proben geworden. Das folgende Protokoll bietet eine alternative Strategie, Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF), mit vielen Vorteilen im Vergleich zu herkömmlichen Immunoblotting. Dies ist ein Antikörper-basierte, automatisierte, schnelle und quantitative Methode, in der eine vollständige westlichen befleckenden Verfahren innerhalb einer ultradünnen Kapillare stattfindet. Diese Technik erfordert eine Gel auf eine Membran, Abisolieren von Flecken, übertragen und x-ray-Filme, die in der Regel für konventionelle Immunoblotting erforderlich sind. Hier werden Proteine getrennt nach ihrer Ladung (isoelektrischen Punkt, pI), Verwendung von weniger als einem Mikroliter (400 nL) des gesamten Proteins lysate. Nach Elektrophorese, sind Proteine auf die Kapillarwände durch UV-Licht-Behandlung, gefolgt von primären und sekundären (Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugiert) immobilisierten Antikörper Inkubationszeit, dessen Bindung durch erkannt wird verbessert Chemilumineszenz (ECL), erzeugen ein Lichtsignal, die gefangen genommen und von einer – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera aufgenommen werden kann. Das Digitalbild können analysiert und quantifiziert (Peakfläche) mit Software. Dieses Hochdurchsatz-Verfahren kann 96 Proben gleichzeitig bearbeiten; ist hochempfindlich, mit Proteindetektion im Bereich von Picogram; und produziert hoch reproduzierbare Ergebnisse durch Automatisierung. All diese Aspekte sind sehr wichtig, wenn die Menge von Proben (z.B., Gewebeproben und Biopsien) ein limitierender Faktor ist. Die Technik hat breitere Anwendungsmöglichkeiten, inklusive Screening von Drogen oder Antikörper, Entdeckung von Biomarkern und diagnostische Zwecke.
Introduction
Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF) ist eine automatisierte, Kapillar-basierte Immunoassay, der Proteine auf der Grundlage ihrer Ladung1,2,3aufgelöst wird. Es ist hoch reproduzierbare und auflösen, Proteine und ihre posttranslational modifizierten Isoformen schnell und quantitativ. Es stellt eine Alternative zu herkömmlichen Methoden wie westliche Beflecken. Während westliche Beflecken sehr gut ist für die Anwesenheit von reichlich Proteine in leicht zugänglichen Proben bestätigen; Variabilität, Verbrauch und genaue Quantifizierung aller anwesenden Herausforderungen, insbesondere bei der Prüfung, biologische Gewebeproben. In der Tat Variabilität ist eine inhärente Problem in westliche Beflecken, denn es gibt zahlreiche Schritte, wie laden und Ausführen von SDS-PAGE Gelen, Transfer von Proteinen auf der Membran, Inkubation mit verschiedenen Reagenzien (zB., primäre und sekundäre Antikörper, ECL), und die Entwicklung auf x-ray Film4. Derzeit ist die western Blot-Technik bei der Umsetzung der digitalen Aufnahmetechnik Chemolumineszenz Signale (Western digital) verbessern. Vor kurzem, ein automatisiertes western Blot-System wurde entwickelt, nämlich die Kapillare westlichen, die ein Freisprech- und Gel-freies System ist. Der gesamte Test ist automatisiert nach das Laden von einem Probenteller (Proben mit allen notwendigen Reagenzien) in das System3,4. Das Instrument wird alle Schritte wie Protein Trennung, Immobilisierung von Proteinen auf Kapillare Wand, Antikörper Inkubationen wäscht zwischen verschiedenen Stufen und Entwicklung und Quantifizierung der Chemilumineszenz-Signale. So bietet die Polizeichefs Verfahren hier vorgestellten höhere Auflösung und Empfindlichkeit.
Diese Methode ist empfindlich, da Signale generiert und von Pikogramm Proteine1quantifiziert werden können. Die hohe Empfindlichkeit mit hervorragende Reproduzierbarkeit macht diese Technologie sehr nützlich für die Analyse von klinischen Proben. Es kann zu erkennen sowie Post translationale Modifikation (z. B. verschiedene phosphorylierten Proteine Isoformen) von Proteinen zu unterscheiden. Diese Technologie wurde erfolgreich verwendet, um unterschiedliche Signalisierung Wege4,5 in klinischen Studien zur Entwicklung neuen Therapeutika in Krebs3zu sezieren, und es hat ein großes Potenzial für Protein Biomarker und Drug discovery .
Protocol
Representative Results
Discussion
Empfindlichkeit und Auflösung von Proteinen sind entscheidend für die Proteomik Forschung an biologischen Proben. Es ist großer Wert in der Lage, Proteine zu erkennen, die in kleinsten Mengen in den Zellen vorhanden sind. Polizeichefs bieten verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung für den Nachweis von Proteinen und deren Isoformen4.
Diese Technologie wird erfolgreich in vielen Proteomic Forschung Berichte5,6</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt Prof. Lena Claesson-Welsh, Universität Uppsala, Schweden für ihre Unterstützung für die Entwicklung dieses Projekts. Darüber hinaus dank der Autor Ross Smith und Lena Claesson-Welsh, Uppsala Universität für ihre kritischen Lektüre und Vorschläge zur Verbesserung der Handschrift.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Riferimenti
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
