검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화
Summary
여기, 선물이 탐지 및 정량화의 변형 체 falciparum 감염 수성 적혈구 감쇠 총 반사 적외선 분석기 및 다변량 데이터 분석을 사용 하는 프로토콜.
Abstract
복수 데이터 분석 (와 함께에서 간단한 벤치탑 감쇠 총 반사 푸리에 변환 적외선 (ATR FTIR) 분석기를 사용 하 여 정량화 하는 방법 및 수성 적혈구 (Rbc)에 기생충의 탐지 설명 MVDA)입니다. 3D 7 P. falciparum 10 %parasitemia 링 무대 기생충에 교양 있었다 및 시리즈를 만들 희석 0-1 사이의 절연 신선한 기증자 Rbc 스파이크 사용 %. 10 µ L 각 샘플의 스펙트럼을 얻으려고 ATR 다이아몬드 윈도우의 중앙에 배치 했다. 샘플 데이터 취급 신호 대 잡음 비를 개선 하 고 물의 기여를 제거 하 고 두 번째 파생 스펙트럼 기능 해결에 적용 했다. 데이터 다음 MVDA의 두 종류를 사용 하 여 분석 했다: 어떤 outliers 그리고 부분 최소 제곱 회귀 (PLS-R) 정량화 모델 확인 첫 번째 주요 구성 요소 분석 (PCA).
Introduction
말라리아는 우리 시대의; 가장 치명적인 질병 중 하나입니다. 발병 지역에서 위험이 절반 이상의 인구가 살고 그리고 그것은 어울리지 않게 가난한1,2,,34짐. 문제의 큰 부분 무 증상 사업자 및 초기 단계 환자5모기 벡터 대 한 저수지 역할을 젖은 계절 중에 감염의 스파이크를 일으키는 원인이 되 고 지역 사회에서 계속 하 허용 이다. 말라리아는 가장 치명적인 질병2의 가장 심각한 형태를 일으키는 원인이 되는 P. falciparum 은 5 변형 체 기생충에 의해 발생 합니다.
현재, 말라리아의 진단 위한 기술을 완벽 미만입니다. 광학 현미경 검사 법, 현재 골드 표준만 사용 되는 방법6에 따라 62-88 기생충 / µ L를 검색할 수 있습니다. 많이 하 고 많은 지역 현미경 오진에서 요구 하는 높은 기술 때문에 또한, >의 경우 50%, 특히 그 낮은 parasitaemia 레벨2는 직접의 영역에 리소스 부족에 기 인할 수 있다 안티-말라리아 약의 오용입니다. 다른 2 주요 진단 메서드는 급속 한 진단 테스트 (RDTs), 검색 및 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험, 차별 하 고 계량 DNA에서 기생충에 대 한 항 체를 활용 하는. 현재, RDTs만 치료 되는 질병의 희귀 한 형태로 발생 하는 혈액의 적어도 100 기생충 / µ L의 P. vivax 그리고 P. falciparum 감지 수 있습니다. 7 , 8 반대로, PCR 분석 실험 차별 및 감도 0.0004-5의 변형 체 의 종 계량 기생충 / µ L의 혈액. 그러나, 그것은 비싼 시 약, 장비 및 기술, 필요 하 고 따라서 필드 응용 프로그램에 적합 하지 않습니다.
매우 민감한, 안정적이 고 저렴 한 기술 때 진단 시간을 따라서 환자 결과 개선 및 질병 제거를 가능 하 게 하 고 향상 시키기 위해 필수적 이다. 감쇠 총 반사 푸리에 변환 (ATR FTIR) 분광학이이 문제에 대 한 잠재적인 해결책을 제공합니다. 이전 작업으로 감지 하 고 고정 피 영화의 검출 한계를 달성 하는 메탄올에 P. falciparum 계량 가능 했다 나타났습니다 < 혈액의 1 기생 / µ L (< 0.0002 %parasitemia)9, PCR 방법에 비해. 최근 연구 결과 검출 및 계량 수성 샘플에서 기생충 따라서 정착 단계를 제거 하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 수증기, 스펙트럼 잡음 및 데이터 처리 같은 요인 최적의 결과10고려 될 필요가 있다.
이 프로토콜 ATR FTIR 스펙트럼을 취득 하 고 수성 적혈구 (RBC) 샘플10 P. falciparum 에의 검출에 대 한 회귀 모델을 준비 하는 방법 새 사용자를 표시 하는 것을 목표로.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R 모델은 Y 선형 관계를 찾는 감독된 복수 방법 = bX + E, 예측 변수 X 사이 (여기에서, 각 wavenumber에 흡 광도)와 연속 변수 Y (여기, parasitemia 수준). 모델 변수 x Y, X 상관에 차이 캡처 잠재 변수 (LVs)의 새로운 집합을 만들 결합 하 고 회귀 벡터 (b)를 계산 하는 즉, 새로운 스펙트럼 결과 y 값의 추정에 의해 하는. 모델의 강도 두 값에서 반입할 수 있습니다: R2 값과 평균 제곱근 오차의 교차 유?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
호주 연구 협의회에 의해 제공 된 저자에 게 자금 (BRW 미래 친목 FT120100926), 국가 건강 및 의료 연구 위원회의 호주 (프로그램 그랜트와 수석 연구 친목 JGB; 초기 경력 동호회 JSR; 연구 인프라 지원 체계 부여 버넷 연구소 연구소), 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 버넷 연구소를 부여. 우리 경 음악 지원 씨 Finlay 정강이 인정합니다.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
Riferimenti
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
