مجهرية على أساس أساليب التقييم للهجرة الخلية الظهارية أثناء التئام الجرح في المختبر
Summary
هذه المخطوطة يصف كيف شق مثل الآفات على الخلايا الظهارية مثقف مونولاييرس مريح نموذج الجرح الشفاء في المختبر، مما يسمح للتصوير بواسطة [كنفوكل] أو الفحص المجهري بالليزر، والتي يمكن أن توفر جودة عالية البيانات الكمية والنوعية لدراسة سلوك الخلية والآليات المعنية بالهجرة.
Abstract
الهجرة الخلية جانب إلزامي لالتئام الجروح. إنشاء اصطناعية الجروح في نماذج حيوانية للبحث غالباً ما تكون النتائج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، بينما يحتمل أن تفتقر إلى الدقة. الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية منبرا مناسباً للبحث عن سلوك الخلية المهاجرة في التئام الجروح وأثر العلاجات في هذه الخلايا. غالباً ما يتم دراسة فسيولوجيا الخلايا الظهارية في ظروف غير روافد؛ بيد هذا النهج قد لا تشبه الجرح الطبيعية شفاء الظروف. تعطيل تكامل ظهارة بالوسائل الميكانيكية يولد نموذج واقعي، ولكن يمكن أن تعوق تطبيق التقنيات الجزيئية. ونتيجة لذلك، الأمثل لدراسة الهجرة الخلية الظهارية تقنيات الفحص المجهري على أساس في المختبر. هنا نحن التفصيل طريقتين محددة والمقايسة الصفر الجرح مصطنعة والمقايسة الجبهة الهجرة المصطنعة، التي يمكن الحصول على البيانات الكمية والنوعية، على التوالي، على أداء الخلايا الظهارية المهاجرة.
Introduction
الهجرة الخلية المطلوب لالتئام الجروح، كما أنها مسؤولة عن الإغلاق النهائي للفجوة الظهارية وترميم السطح تعطلت1. أداء الجروح الاصطناعية في نماذج حيوانية يسمح بتكرار هذه العملية المعقدة بالقرب من الظروف الفسيولوجية2. ومع ذلك، غالباً ما يؤدي هذا النهج في إجراءات تجريبية مكلفة ومعقدة، التي يحتمل أن تكون تفتقر إلى الدقة لدراسة عمليات متميزة، بسبب الطبيعة المعقدة لعملية التئام الجروح.
الثقافة في المختبر من خطوط الخلايا الظهارية يوفر بديلاً مفيداً لنماذج حيوانية للبحث في الدور الذي تؤديه هذه الخلايا في التئام الجروح وآثار العلاج على سلوك الخلية المهاجرة. وكثيراً ما هو درس فسيولوجيا الخلايا الظهارية من التقنيات الجزيئية باستخدام غير روافد الثقافات3،4،،من56؛ ومع ذلك، عادة ما يتحقق الإخلال بسلامة ظهارة بغرامة شقوق الميكانيكية. في الخلية والثقافة، وهذا يعني أن عدد لا يذكر من الخلايا يمكن أن تتعرض إلى الفجوة الجرح، وهي تمثل عينة صغيرة جداً لتقنيات البيولوجيا الجزيئية. ومع ذلك، يمكن دراسة هذه الآفات على المستوى المجهري، مع استفادة خصائص بعض خطوط الخلايا الظهارية، مثل الخلية “الظهارية المنك الرئة” (Mv1Lu) أو الخلايا keratinocyte الإنسان عفويا مخلدة (هاكات) الفطرية المهاجرة خطوط.
هنا وصفت لنا طريقة للفحص المجهري مناسب للحصول على بيانات كمية عن هجرة الخلايا الظهارية في سياق الجرح الشفاء3،4،،من78. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم الطرق الإضافية التي قد تكون مفيدة لدراسة التغيرات الجزيئية نوعيا والمورفولوجية التي تحدث في مونولاييرس طلائي أثناء الترحيل. عموما، هذه الأساليب توفر إطارا لدراسة ديناميات والتغييرات الشكلية التي تشارك مع سلوك الخلايا الظهارية واستجابة للعلاج أثناء التئام الجروح.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الجلد أو الأغشية المخاطية التعطيل، يتم استعادة وظيفة حاجز الأعمال التي تقوم بها العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الليفية أو الخلايا الظهارية ومحصنة. مربوط، تخضع هذه الخلايا معقدة العملية التي تنطوي على المبرمج وانتشارها، والتمايز، والأهم من ذلك، تنتجها الخلايا الليفية وط…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نريد أن نعطي بفضل كبار أعضاء المختبر التي تساعد في تحسين وصقل هذه التقنيات إلى حالته الفعلية: د. سيليا مارتينيز-مورا؛ أنا الدكتور مروويك والدكتور كاتالينا رويز-كانيادا والدكتور أنطونيا الكاراز-غارسيا. ونحن مدينون لمستشفى Clínico الجامعي فيرجن de la اريتشاكا لدعم تطوير هذه التقنيات بشدة. كما دي معهد الصحة كارلوس الثالث، Sanitarias فوندو للبحوث. خطة استاتال أنا + د + أنا ومعهد دي السعود كارلوس الثالث-Subdirección العامة دي تقييم y Investigación de la الحكوميتين (منحة رقم: PI13/00794)؛ www.isciii.es-FEDER Fondos “أونا manera de hacer Europa”. ونشكر أيضا جامعة دي مورسيا، إيميب-اريتشاكا وفيس للدعم الإداري والمساعدة. وأخيراً، نحن نريد أن نعطي خاصة بفضل الدكتورة إيزابيل مارتينيز-أرجودو وفي كلية العلوم عليه ص Bioquímica، حرم تكنولوجيا البحار de la مومنتم دي أرماس، جامعة قشتالة لامانشا، توليدو لدعمهم الطيبة في التنازل عن طيب خاطر الطب الحيوي ومختبر التكنولوجيا الحيوية تجعل من الممكن تصوير جزء من هذه الورقة.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
Riferimenti
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
