Mikroskopi baseret metoder til vurdering af epitelcelle Migration under In Vitro sårheling
Summary
Dette manuskript beskriver hvordan snit-lignende læsioner på kulturperler epitelcelle encellelag bekvemt model sår healing i vitro, giver mulighed for billeddannelse af Konfokal eller laser scanning mikroskopi, og som kan give høj kvalitet kvantitative og kvalitative data for at studere både celle adfærd og de mekanismer, der er involveret i migration.
Abstract
Celle migration er et obligatorisk aspekt for sårheling. At skabe kunstige sår på forskning dyremodeller ofte resultater i dyre og komplicerede eksperimentelle procedurer, mens potentielt mangler i præcision. In vitro kultur epitelcelle linjer udgør en passende platform for forske celle vandrende opførsel i sårheling og virkningen af behandlinger på disse celler. Fysiologi af epitelceller er ofte studerede i ikke-sammenflydende betingelser; dog kan denne tilgang ikke ligne naturlige sårheling betingelser. Forstyrre epitel integritet mekanisk genererer en realistisk model, men kan haemme anvendelsen af molekylærbiologiske teknikker. Mikroskopi baseret teknikker er derfor optimal for at studere epitelcelle migration in vitro-. Vi detalje her to specifikke metoder, kunstige sår scratch analysen og kunstige migration front assay, der kan få kvantitative og kvalitative data, henholdsvis på vandrende udførelsen af epitelceller.
Introduction
Celle migration er nødvendig for sårheling, som er ansvarlig for den endelige lukning af epitel hullet og restaurering af den forstyrrede overflade1. Udfører kunstige sår i dyremodeller giver mulighed for replikering af denne komplekse proces i nærheden af fysiologiske forhold2. Men denne tilgang ofte resulterer i dyre og komplicerede eksperimentelle procedurer, der potentielt mangler præcision for studiet af adskilte processer, på grund af den indviklede karakter af sårheling proces.
In vitro kultur epitelcelle linjer giver et nyttigt alternativ til dyremodeller for forske disse celler rolle i sårheling og effekten af behandling på celle vandrende adfærd. Fysiologi af epitelceller er ofte studerede af molekylære teknikker, der anvender ikke-sammenflydende kulturer3,4,5,6; afbrydelse af epitel integritet opnås normalt ved fine mekaniske indsnit. I cellekultur indebærer dette, at ubetydelige antal celler kan blive udsat for sår hul, og de repræsenterer en for lille stikprøve til molekylærbiologiske teknikker. Men disse læsioner kan studeres på mikroskala, drage fordel af de medfødte vandrende egenskaber af nogle epitelial cellelinjer, såsom den Mink lunge epitelcelle (Mv1Lu) eller cellen spontant udødeliggjort humane keratinocytter (HaCaT) linjer.
Her beskrevet vi en metode til mikroskopi, der er egnet til at få kvantitative data migration af epitelceller i forbindelse med sårheling3,4,7,8. Desuden præsenterer vi yderligere metoder, der er nyttige at studere kvalitativt molekylære og morfologiske ændringer forekommer på epitelial encellelag under overflytningen. Samlet set giver disse metoder en ramme for at studere både dynamik og morfologiske ændringer involveret med epitelcelle adfærd og reaktion på behandlinger i løbet af sårheling.
Protocol
Representative Results
Discussion
På huden eller slimhinderne forstyrrelser gendannes barriere funktion af mange celletyper, herunder fibroblaster eller epitel og immun celler handlinger. Conjointly, disse celler undergår en kompleks proces, der involverer apoptose, spredning, differentiering og vigtigere, fibroblast og epitelial celle migration, som er den ultimative mekanisme, der er ansvarlig for genoprettelse af forstyrret væv og den lukning af overfladiske epitelial hul1,12 således, at s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker at give tak til ældre medlemmer af laboratoriet, der hjælper med at forbedre og forfine disse teknikker til at dets faktiske tilstand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada og Dr. Antonia Alcaraz-García. Vi står i gæld til Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca for kraftigt støtte udviklingen af disse teknikker. Også til Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planlægge Estatal jeg + D + jeg og Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr.: PI13/00794); www.isciii.es. omkostninger FEDER “Una manera de hacer Europa”. Vi takker også Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca og FFIS for administrativ støtte og bistand. Endelig vil vi gerne give en særlig tak til Dr. Isabel Martínez-Argudo og den Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo for deres venlige støtte i villigt afgivende den Biomedicin og bioteknologi laboratorium til at gøre muligt filmet til en del af dette papir.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
Riferimenti
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
