Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie
Summary
Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.
Abstract
Cel migratie is een verplicht onderdeel voor wondgenezing. Creëren van kunstmatige wonden op onderzoek diermodellen resulteert vaak in dure en ingewikkelde experimentele procedures, terwijl potentieel ontbreekt in precisie. In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een geschikt platform voor het onderzoeken van het trekgedrag van de cel in de wondgenezing en het effect van de behandelingen op deze cellen. De Fysiologie van epitheliale cellen is vaak bestudeerd in niet-heuvels voorwaarden; Deze benadering kan echter niet lijken op natuurlijke wond genezing voorwaarden. Verstoren van de epitheel integriteit door mechanische middelen genereert een realistisch model, maar de toepassing van moleculaire technieken kan belemmeren. Bijgevolg gebaseerd microscopie technieken zijn optimaal voor de studie van epitheliale cel migratie in vitro. Hier detail wij twee specifieke methoden, de kunstmatige wond kras assay en de voorste assay van kunstmatige migratie, die van kwantitatieve en kwalitatieve gegevens, respectievelijk op de trekkende prestaties van epitheliale cellen verkrijgen kan.
Introduction
Cel migratie is vereist voor wondgenezing, want het is verantwoordelijk voor de definitieve sluiting van de epitheliale kloof en herstel van de verstoorde oppervlakte1. Uitvoeren van kunstmatige wonden in diermodellen zorgt voor de replicatie van dit complexe proces in in de buurt van fysiologische omstandigheden2. Deze benadering leidt echter vaak dure en ingewikkelde experimentele procedures, die mogelijk gebrek aan precisie voor de studie van de verschillende processen, het ingewikkelde karakter van de wondgenezing proces.
In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een nuttig alternatief voor dierlijke modellen voor het onderzoeken van de rol die deze cellen bij wondgenezing en de effecten van behandeling op cel trekgedrag spelen. De Fysiologie van epitheliale cellen wordt vaak bestudeerd door moleculaire technieken met behulp van niet-heuvels culturen3,4,5,6; echter, de verstoring van de integriteit van het epitheel wordt gewoonlijk bereikt door fijne mechanische insnijdingen. In de cultuur van de cel impliceert dit dat te verwaarlozen aantal cellen kan worden blootgesteld aan de wond kloof, en zij een te kleine steekproef voor moleculaire biologietechnieken vertegenwoordigen. Echter, deze letsels kunnen worden bestudeerd op de microscopische schaal, profiteren van de aangeboren trekkende eigenschappen van sommige epitheliale cellijnen, zoals de Mink Lung epitheliale cel (Mv1Lu) of de spontaan vereeuwigd menselijke Keratinocyt (HaCaT) lijnen.
We beschreven hier een methode voor microscopie die geschikt is voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de migratie van epitheliale cellen in het kader van de wond genezing van3,4,7,8. Bovendien presenteren we extra methoden die zijn nuttig om te studeren kwalitatief moleculaire en morfologische veranderingen op epitheliale monolayers tijdens de migratie. Over het geheel genomen is deze methoden bieden een kader om te studeren zowel de dynamiek en de morfologische veranderingen die betrokken zijn bij de epitheliale cellen gedrag en reactie op de behandelingen tijdens de wondgenezing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op de huid of slijmvlies verstoring, is barrièrefunctie hersteld door de acties van talrijke celtypen, met inbegrip van fibroblasten of epitheliale en immuun cellen. Gezamenlijk, deze cellen ondergaan een complex proces waarbij apoptosis, proliferatie, differentiatie en bovenal fibroblast en epitheliale cel migratie, die het ultieme mechanisme verantwoordelijk voor herstel van de verstoorde weefsel is en de sluiting van de oppervlakkige epitheliale kloof1,12 ald…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen geven dankzij de oudere leden van de lab die helpen te verbeteren en verfijnen van deze technieken om de feitelijke toestand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada en Dr. Antonia Alcaraz-García. We zijn dank verschuldigd aan het ziekenhuis klinisch Universitario Virgen de la Arrixaca voor zijn krachtige steun van de ontwikkeling van deze technieken. Ook het Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal ik + D + ik en Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER “Una manera de hacer Europa”. Wij danken ook Universidad de Murcia en IMIB-Arrixaca FFIS voor administratieve ondersteuning en bijstand. Tot slot willen we een speciale dank aan Dr. Isabel Martínez-Argudo en de Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus autonoom de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo voor hun vriendelijke ondersteuning in gewillig cederende geven de Biogeneeskunde en biotechnologie laboratorium mogelijk te maken het gefilmde deel van dit document.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
Riferimenti
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
