Méthodes basées sur la microscopie pour l’évaluation de la Migration de cellules épithéliales lors In Vitro la cicatrisation des plaies
Summary
Ce manuscrit décrit comment incision-comme des lésions sur des monocouches de cellules épithéliales cultivées idéalement modèle embobiné guérison in vitro, permettant pour l’imagerie confocale ou microscopie à balayage de laser, et qui peuvent fournir de haute qualité données quantitatives et qualitatives pour l’étude de comportement de la cellule tant les mécanismes impliqués dans la migration.
Abstract
La migration cellulaire est un aspect obligatoire pour la cicatrisation des plaies. Création artificielle plaies sur des modèles animaux de recherche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, tandis que potentiellement manque de précision. In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une plate-forme appropriée pour des recherches sur le comportement migratoire de cellule dans la cicatrisation des plaies et l’impact des traitements sur ces cellules. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée dans des conditions non-confluent ; Toutefois, cette approche ne peut pas ressembler à conditions de cicatrisation naturelle. Perturbant l’intégrité de l’épithélium par des moyens mécaniques, génère un modèle réaliste, mais peut faire obstacle à l’application des techniques moléculaires. En conséquence, les techniques de microscopie basée sont optimales pour l’étude de la migration de cellules épithéliales in vitro. Nous détaillons ici deux méthodes spécifiques, le dosage zéro blessure artificiel et le dosage avant migration artificielle, qui peut obtenir des données quantitatives et qualitatives, respectivement, sur les performances migratoires des cellules épithéliales.
Introduction
La migration cellulaire est nécessaire pour la cicatrisation des plaies, car elle est responsable de la fermeture définitive de l’écart épithélial et de la restauration de la surface perturbée1. Effectuant des blessures artificielles dans des modèles animaux permet la réplication de ce processus complexe en proches des conditions physiologiques2. Toutefois, cette approche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, qui potentiellement manquent de précision pour l’étude des processus distincts, étant donné la nature complexe du processus de cicatrisation.
In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une alternative utile aux modèles animaux pour des recherches sur le rôle que ces cellules jouent dans la cicatrisation des plaies et les effets du traitement sur le comportement migratoire de cellule. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée par des techniques moléculaires à l’aide de cultures non-anastomosé3,4,5,6; Cependant, la rupture de l’intégrité de l’épithélium est habituellement obtenue par fines incisions mécaniques. En culture cellulaire, cela implique qu’un nombre négligeable de cellules peut-être être exposé à l’écart de la plaie, et qu’ils représentent un échantillon trop petit pour les techniques de biologie moléculaire. Cependant, ces lésions peuvent être étudiées à l’échelle microscopique, en profitant des propriétés migrateurs innées de certaines lignées de cellules épithéliales, comme le poumon de vison Epithelial cell (Mv1Lu) ou la cellule spontanément immortalisées humain des kératinocytes (HaCaT) lignes.
Ici, nous avons décrit une méthode de microscopie qui convient obtenir des données quantitatives sur la migration des cellules épithéliales dans le contexte de la cicatrisation3,4,7,8. Par ailleurs, nous présentons des méthodes supplémentaires qui sont utiles pour étudier les changements qualitativement moléculaires et morphologiques qui se produisent sur des monocouches épithéliales pendant la migration. Dans l’ensemble, ces méthodes fournissent un cadre pour étudier la dynamique et les changements morphologiques impliqués avec le comportement de cellules épithéliales et de réponse aux traitements durant la cicatrisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sur la peau ou les muqueuses perturbation, fonction de barrière est restaurée par les actions de nombreux types de cellules, y compris les fibroblastes ou les cellules épithéliales et immunitaires. Conjointement, ces cellules subissent un complexe processus impliquant l’apoptose, prolifération, différenciation et surtout, des fibroblastes et epithelial cell migration, qui est le mécanisme ultime responsable de la restauration du tissu perturbé et le fermeture de l’écart épithéliale superficielle<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous voulons rendre grâce pour les membres plus âgés du laboratoire qui aident à améliorer et affiner ces techniques à son état actuel : Dr Celia Martinez-Mora ; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Cañada et Dr Antonia Alcaraz-García. Nous sommes redevables à l’hôpital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de soutenir fortement le développement de ces techniques. Aussi, l’Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I et Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant no : PI13/00794) ; www.ISCIII.es. Fondos FEDER « Una manera de hacer Europa ». Nous remercions également Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca et FFIS d’assistance et de soutien administratif. Enfin, nous voulons donner Merci Dr Isabel Martínez-Argudo et la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo pour leur aimable soutien à céder volontairement le Biomédecine et laboratoire de biotechnologie de rendre possible la partie filmée du présent document.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
Riferimenti
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
