La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata
Summary
Questo manoscritto descrive come incisione-come le lesioni fatta su monostrati di cellule epiteliali in coltura convenientemente modello ferita curativa in vitro, che consente per l’imaging di confocal o microscopia di esame del laser, e che in grado di fornire alta qualità dati quantitativi e qualitativi per studiare il comportamento delle cellule sia i meccanismi coinvolti nella migrazione.
Abstract
Migrazione delle cellule è un aspetto obbligatorio per la guarigione della ferita. Creazione artificiale ferite su modelli animali di ricerca spesso risultati in costose e complicate procedure sperimentali, mentre potenzialmente manca di precisione. Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce una piattaforma adatta per la ricerca il comportamento migratorio delle cellule nella guarigione delle ferite e l’impatto dei trattamenti su queste cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata in condizioni di non-confluenti; Tuttavia, questo approccio non analoghe condizioni di guarigione naturale. Compromettere l’integrità dell’epitelio con mezzi meccanici genera un modello realistico, ma può ostacolare l’applicazione delle tecniche molecolari. Di conseguenza, tecniche di microscopia di base sono ottimali per lo studio della migrazione delle cellule epiteliali in vitro. Qui dettagliamo due metodi specifici, il dosaggio di gratta e Vinci di ferita artificiale e analisi anteriore della migrazione artificiale, che può ottenere dati quantitativi e qualitativi, rispettivamente, sulle prestazioni migratoria delle cellule epiteliali.
Introduction
Migrazione delle cellule è necessaria per la guarigione delle ferite, come è responsabile per la chiusura definitiva del divario epiteliale e restauro del perturbato superficie1. L’esecuzione di ferite artificiali nei modelli animali consente per la replica di questo complesso processo in vicino a condizioni fisiologiche2. Tuttavia, questo approccio comporta spesso costose e complicate procedure sperimentali, che potenzialmente mancano di precisione per lo studio di processi distinti, a causa della natura complessa del processo di guarigione.
Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce un’utile alternativa ai modelli animali per la ricerca il ruolo che queste cellule svolgono nella guarigione della ferita e gli effetti del trattamento su comportamento migratore delle cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata mediante tecniche molecolari utilizzando colture non-confluenti3,4,5,6; Tuttavia, la rottura dell’integrità dell’epitelio viene solitamente ottenuta da fini incisioni meccaniche. Nella coltura cellulare, questo implica che trascurabile numero di cellule può essere esposti al divario di ferita, e che rappresentano un campione troppo piccolo per tecniche di biologia molecolare. Tuttavia, queste lesioni possono essere studiate su scala microscopica, sfruttando le proprietà innate migratori di alcune linee cellulari epiteliali, come il visone epiteliali del polmone delle cellule (Mv1Lu) o la cella spontaneamente immortalizzate dei cheratinociti umani (HaCaT) linee.
Qui abbiamo descritto un metodo per microscopia che è adatto per ottenere dati quantitativi sulla migrazione delle cellule epiteliali nel contesto della cicatrizzazione3,4,7,8. Inoltre, vi presentiamo ulteriori metodi che sono utili per studiare i cambiamenti qualitativamente morfologiche e molecolari che si verificano su monostrati epiteliali durante la migrazione. Nel complesso, questi metodi forniscono un quadro per studiare la dinamica e il cambiamenti morfologici coinvolti con il comportamento delle cellule epiteliali e la risposta ai trattamenti durante la guarigione della ferita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alla pelle o rottura della membrana mucosa, la funzione della barriera viene ripristinata dalle azioni di numerosi tipi di cellule, tra cui fibroblasti o cellule epiteliali ed immuni. Congiuntamente, queste cellule subiscono un complesso processo che coinvolge l’apoptosi, proliferazione, differenziazione e soprattutto, dei fibroblasti ed epiteliale delle cellule migrazione, che è il meccanismo ultimo responsabile per il restauro del tessuto perturbato e la chiusura del divario epiteliale superficiale1<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo ringraziare i membri più anziani del laboratorio che aiutano a migliorare e perfezionare queste tecniche allo stato effettivo: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada e Dr. Antonia Alcaraz-García. Siamo in debito con l’Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca per sostenere fortemente lo sviluppo di queste tecniche. Anche l’Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Piano Estatal I + D + io e Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (n. Grant: PI13/00794); www.ISCIII.es. Fondos FEDER “Una manera de hacer Europa”. Ringraziamo anche Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca e FFI per assistenza e supporto amministrativo. Infine, vogliamo dare un ringraziamento speciale Dr. Isabel Martínez-Argudo e la Facultad de Ciencias y Ambientales Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo per il loro supporto gentile in volentieri cedendo il Biomedicina e biotecnologie laboratorio per rendere possibile la parte filmata di questa carta.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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