현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한
Summary
이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.
Abstract
셀 이동은 상처 치유에 대 한 의무적 측면 이다. 인공 생성 상처 연구 동물 모델에 비용과 복잡 한 실험 절차에 자주 결과 정밀도에서 잠재적으로 부족 한 동안. 상피 세포의 생체 외에서 문화는 상처 치유와이 세포에 치료의 영향에 셀 철새 행동 연구를 위한 적합 한 플랫폼을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 조건;에서 공부 그러나,이 방법은 자연 상처 치유 조건 닮은 하지 않을 수 있습니다. 기계적 방법으로 상피 무결성을 방해 현실적인 모델을 생성 하지만 분자 기술 응용 프로그램을 방해 수 있습니다. 따라서, 현미경 기반 기술을 상피 세포 이동 공부에 대 한 최적의 생체 외에서. 여기 우리는 두 가지 구체적인 방법, 인공 상처 스크래치 분석 결과 및 인공 마이그레이션 전면 분석 결과, 상피 세포의 이동 성능에 각각, 양적 및 질적 데이터를 얻을 수 있는 선발.
Introduction
셀 이동은 상피 갭의 최종 폐쇄와 방해 표면1의 복원에 대 한 책임은 상처 치유, 필요 합니다. 생리 적인 조건2근처에이 복잡 한 과정의 복제 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 종종 비용과 복잡 한 실험 절차, 잠재적으로 상처 치유 과정의 복잡 한 특성으로 인해 개별 프로세스의 연구에 대 한 정밀 부족 발생 합니다.
상피 세포의 생체 외에서 문화는 역할이이 세포에 상처 치유와 셀 철새 행동 치료의 효과 연구를 위한 동물 모델에 대 한 유용한 대안을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 문화3,4,,56;를 사용 하 여 분자 기술로 공부 그러나, 상피 무결성 중단 일반적으로 정밀한 기계 절 개 함으로써 이루어집니다. 세포 배양에서이 셀의 무시할 수 상처 격차에 노출 될 수 있습니다 그리고 그들은 분자 생물학 기술에 대 한 너무 작은 샘플을 나타내는 의미 합니다. 그러나, 이러한 병 변 밍 크 폐 상피 세포 (Mv1Lu) 또는 자발적으로 불멸 하 게 인간의 keratinocyte (HaCaT) 셀 등 일부 상피 세포 라인의 타고 난 철새 속성의 활용, 미세한 규모에서 공부 될 수 있다 라인입니다.
여기 우리는 상처 치유3,4,,78의 맥락에서 상피 세포의 마이그레이션에 양적 데이터를 얻기 위해 적당 한 현미경 검사 법에 대 한 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 마이그레이션 중 상피 monolayers에 발생 질적으로 분자와 형태학 상 변화를 공부 도움이 되는 추가 방법을 제시. 전반적으로, 이러한 메서드는 상처 치유 하는 동안 역학과 상피 세포 행동 및 치료에 대 한 응답으로 관련 된 형태학 상 변화를 공부 하는 프레임 워크를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
피부 또는 점 막 파열, 수많은 종류의 세포, 섬유 아 세포 또는 상피와 면역 세포를 포함 하 여 행동에 의해 장벽 기능 복원 됩니다. 이 세포는 복잡 한을 받아야 하는 conjointly, apoptosis, 확산, 차별화, 그리고 중요 한 것은, 섬유 관련 된 프로세스 및 상피 세포 궁극적인 메커니즘 방해 조직의 복원에 대 한 책임은 마이그레이션 및 표면 상피 간격1,12 따라서…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
개선 하 고 이러한 기술을 실제의 상태를 수정 하는 데 도움이 실험실의 이전 회원 감사 하겠습니다: 모라-닥터 셀 리아 마 르 티 네즈; 박사 안 나 Mrowiec, 닥터 카 탈리 나 루이즈-카나다와 닥터 안토니 아 Alcaraz-가르시아. 우리는 강력 하 게 이러한 기술의 개발을 지원 하기 위한 병원 Clínico 대학교 일 드 라 Arrixaca에 게 빚을입니다. 또한 기관 드 건배 카를로스 III, Fondo 드 Investigaciones Sanitarias. Estatal 계획 나 + D + 어 Instituto de 건배 카를로스 III-Subdirección 일반 드 Evaluación y Fomento 드 라 Investigación (허가 번호: PI13/00794); www.isciii.es. 자금 페더 “Una 마네 드 대처해 유로 파”. 우리 또한 감사 IMIB Arrixaca, 대학 드 무르시아, FFIS 행정 지원 및 지원. 마지막으로, 우리 특별 한 닥터 이사벨 마르티네스-Argudo 고은 Facultad 드 Ciencias Ambientales y Bioquímica, 캠퍼스 Tecnológico 드 라 디렉터리 드 무기, 대학 카스 티 야 라만 차, 톨레도 기꺼이 넘겨주는에 그들의 종류 지원에 대 한 감사를 주고 싶어 여 의학 및 생명 공학 연구소가이 종이의 촬영된 부분을 가능 하 게
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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