Микроскопия на основе методов для оценки миграции эпителиальных клеток во время в Vitro заживление ран
Summary
Эта рукопись описывает, как разрез как поражения на искусственный эпителиальных клеток монослои удобно модель раны исцеления в пробирке, позволяя для воображения, конфокальная или лазерная сканирующая микроскопия, и которые могут обеспечить высокое качество количественные и качественные данные для изучения поведения клеток и механизмы, участвующие в миграции.
Abstract
Миграции клеток является обязательным аспектом для заживления ран. Создание искусственных раны на животных моделях исследования часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, хотя потенциально не хватает точности. В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает подходящую платформу для исследования миграционных поведение ячейки в заживлении ран и влияние лечения на эти клетки. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются в условиях не притока; Однако этот подход может не напоминают природные условия заживления. Нарушения целостности эпителия механическими средствами создает реалистичной модели, но могут препятствовать применению молекулярных методов. Следовательно, микроскопии основанные методы являются оптимальными для изучения миграции эпителиальных клеток в пробирке. Здесь мы подробно два конкретных методов, искусственного рану скретч пробирного и Фронт assay искусственных миграции, который может получить количественные и качественные данные, соответственно, на мигрирующих производительность эпителиальных клеток.
Introduction
Клетки миграции необходим для заживления ран, как он несет ответственность за окончательное закрытие эпителиальных разрыва и восстановлению нарушенных поверхности1. Выполнение искусственных раны в животных моделях позволяет для репликации этого сложного процесса в физиологических условиях2. Однако этот подход часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, которые потенциально не хватает точности для изучения различных процессов, из-за сложного характера процесса заживления раны.
В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает полезной альтернативой животных моделей для изучения роли, которую эти клетки играют в заживлении ран и эффекты лечения на мигрирующих поведение клеток. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются на молекулярных методов с использованием не притока культур3,4,5,6; Однако нарушение целостности эпителия обычно достигается тонкой механической разрезов. В культуре клеток это означает, что незначительное количество клеток могут быть подвержены разрыва раны, и они представляют собой образец слишком мал для методы молекулярной биологии. Однако эти поражения могут быть изучены в микроскопических масштабе, воспользовавшись врожденной мигрирующих свойств некоторых эпителиальных клеток линий, например норки легких эпителиальных клеток (Mv1Lu) или клеток кератиноцитов спонтанно увековечен человека (HaCaT) линии.
Здесь мы описали метод для микроскопии, которая подходит для получения количественных данных о миграции эпителиальных клеток в контексте заживления3,4,,78. Кроме того мы представляем дополнительные методы, которые будут полезны для изучения качественно молекулярных и морфологических изменений, происходящих на эпителиальные монослои во время миграции. В целом эти методы предоставляют основу для изучения динамики и морфологических изменений, связанных с поведением эпителиальных клеток и ответ на лечение во время заживления ран.
Protocol
Representative Results
Discussion
После кожи или слизистой нарушения барьер функция восстанавливается действиями многочисленных типов клеток, включая фибробластов или иммунной и эпителиальных клеток. Слитно, эти клетки проходят комплекс процесса с участием апоптоза, распространения, дифференциация и главное, фиброб…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим дать благодаря пожилых членов лаборатории, которые помогают улучшить и совершенствовать эти методы в фактическое состояние: д -р Селия Мартинес-Мора; Д-р Анна Mrowiec, доктор Catalina Руис Каньяда и доктор Antonia Alcaraz Гарсия. Мы в долгу перед Clínico больница Университарио Virgen де ла Arrixaca для решительно поддержал разработку этих методов. Также Институт де Salud Карлоса III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. План Estatal I + D + I и y Salud Карлоса III-главное Генеральной де исследования де Instituto фоменто де ла Investigación (Грант №: ПЭ13/00794); www.isciii.ES. Fondos ФЕДЕР «hacer Una manera de Europa». Мы также благодарим Universidad de Murcia, Суммирующий-Arrixaca и FFIS для административной поддержки и помощи. Наконец, мы хотим дать отдельное спасибо доктор Изабель Мартинес-Argudo и латиноамериканского факультета de Ciencias y Ambientales Bioquímica, кампус парке де-ла-де-Армас завод, Universidad Кастилья Ла Манча, Толедо за их поддержку в охотно цедирование Биомедицины и биотехнологии лабораторию, чтобы сделать возможным снят частью этой бумаги.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
Riferimenti
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
