Mikroskopi datorbaserade metoder för bedömning av epitelial cellmigration under In Vitro sårläkning
Summary
Detta manuskript beskriver hur snittet-liknande lesioner på odlade epitelial cell enskiktslager bekvämt modell såret helande i vitro, möjliggör avbildning av confocal eller laser scanning mikroskopi, och som kan ge hög kvalitet kvantitativa och kvalitativa data för att studera både cell beteende och mekanismerna som är involverade i flyttning.
Abstract
Cellmigration är en obligatorisk aspekt för sårläkning. Att skapa konstgjorda sår på forskning djurmodeller ofta resulterar i kostsamma och komplicerade experimentella rutiner, medan potentiellt saknar precision. In vitro kultur av epitelceller linjer ger en lämplig plattform för forska cell flyttande beteendet i sårläkning och effekten av behandlingar på dessa celler. Epitelceller fysiologi studeras ofta i icke-konfluenta villkor; Detta tillvägagångssätt kan dock inte liknar naturliga förutsättningar för sårläkning. Störa epitel integritet på mekaniskt sätt genererar en realistisk modell, men kan hindra tillämpningen av molekylärbiologiska metoder. Följaktligen, mikroskopi baserat tekniker är optimal för att studera epitelial cellmigration in vitro-. Här detalj vi två specifika metoder, konstgjorda såret scratch analysen och konstgjorda migration främre analysen, som kan få kvantitativa och kvalitativa data, respektive på flyttande prestanda av epitelceller.
Introduction
Cellmigration krävs för sårläkning, som ansvarar för den slutliga nedläggningen av epitelial klyftan och restaurering av störd ytan1. Utför artificiella sår i djurmodeller möjliggör replikering av denna komplexa process i nära fysiologiska villkor2. Dock leder detta synsätt ofta till kostsamma och komplicerade experimentella rutiner, som potentiellt saknar precision för att studera olika processer, intrikata pågrund av sårläkning processen.
In vitro kultur av epitelceller linjer ger ett bra alternativ till djurmodeller för forska den roll som dessa celler spelar i sårläkning och effekterna av behandling på cell flyttande beteende. Epitelceller fysiologi studeras ofta av molekylära tekniker använder icke-konfluenta kulturer3,4,5,6; störningar av epitel integritet uppnås dock vanligen genom fina mekaniska snitt. Cellodling innebär detta att försumbart antal celler kan utsättas för såret klyftan, och de utgör ett alltför litet urval för molekylärbiologi tekniker. Dock kan dessa lesioner studeras i mikroskopisk skala, utnyttja egenskaperna för medfödda flyttande av vissa epitelceller linjer, såsom Mink Lung epitelial cellen (Mv1Lu) eller cellen spontant förevigade mänskliga keratinocyter (HaCaT) linjerna.
Här har vi beskrivit en metod för mikroskopi som är lämplig att få kvantitativa uppgifter om migration av epitelceller i samband med sårläkning3,4,7,8. Dessutom presenterar vi ytterligare metoder som är bra att studera kvalitativt molekylära och morfologiska förändringar som sker på epitelial enskiktslager under migreringen. Sammantaget ger dessa metoder en ram för att studera både dynamik och morfologiska förändringar med epitelial cell beteende och svar på behandlingar under sårläkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
På hud eller slemhinna störningar återställas barriärfunktion med åtgärderna i många celltyper, däribland fibroblaster eller epitelial och immuna celler. Conjointly, dessa celler genomgår en komplex process som involverar apoptos, proliferation, differentiering och ännu viktigare, fibroblast- och epitelial cell migration, som är den ultimata mekanismen som svarar för restaurering av störd vävnaden och stängningen av ytliga epitelial gap1,12 såled…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill ge tack vare äldre medlemmar i labbet som hjälper till att förbättra och förfina dessa tekniker till dess faktiska tillstånd: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Cañada och Dr. Antonia Alcaraz-García. Vi står i skuld till den Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca för att starkt stödja utvecklingen av dessa tekniker. Även Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planera Estatal jag + D + jag och Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER ”Una manera de hacer Europa”. Vi tackar också Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca och FFIS för administrativt stöd och hjälp. Slutligen vill vi ge ett särskilt tack till Dr Isabel Martínez-Argudo och den Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla-la Mancha, Toledo för deras vänliga stöd i villigt avgivit den Biomedicin och bioteknik laboratorium för att möjliggöra den filmade delen av denna uppsats.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
Riferimenti
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
