Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta
Summary
Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.
Abstract
İnsanlarda kromozom segregasyon hataları yumurta Düşükler ve doğum kusurları çoğunluğu için sorumlu olan. Ayrıca, kadınların yaşlandıkça, hamile kalma aneuploid bir fetus önemli ölçüde artırır ve bu olay riskini maternal yaş etkisi bilinir. Doğru kromozom ayrışma sırasında segregasyonun bölümler için bir gereklilik olduğunu bakım kardeş Kromatit uyum yumurta deneyim genişletilmiş profaz döneminde. Hem insanlar hem de model organizmalar saytolojik kanıtlar segregasyonun uyum süreci yaşlanma sırasında bozulur gösteriyor. Buna ek olarak, insan yumurta segregasyon hataları mayoz sırasında en yaygın olan ben, kol uyum Prematüre kaybı ile tutarlı. Model organizmalar uyum yaş bağımlı kaybı altında yatan mekanizmaları çözülüyor için kritik kullanımıdır. Drosophila melanogaster segregasyonun uyum içinde yumurta Yönetmeliği çalışmak için birçok avantaj sunar. Ancak, yakın zamana kadar sadece genetik testler kol uyum içinde yumurta farklı genotip veya farklı deneysel koşullar altında kaybı için tahlil mevcut idi. Floresans in situ kullanmak için hibridizasyon (balık) doğrudan görselleştirmek için kusurları kol uyum içinde prometafaz içinde ben ve metafaz Drosophila yumurta tutuklandı, detaylı bir iletişim kuralı sağlanmıştır. X kromozomu distal koluna hybridizes bir balık sonda üreten ve confocal Z yığınları toplama, bir araştırmacı, birçok bireysel balık sinyalini üç boyutlu görselleştirme ve kardeş olup olmadığını belirlemek Kromatit kolları ayrılmış. Özetlenen yordamı kol uyum kusurları Drosophila yumurtalar yüzlerce ölçmek olanak sağlar. Bu nedenle, bu yöntem uyum bakım yanı sıra onun ölümü için yaşlanma sürecinde yol açan faktörler katkıda mekanizmaları araştıran için önemli bir araç sağlar.
Introduction
Mitoz ve mayoz sırasında kromozomların uygun segregasyon gerektirir bu kardeş Kromatit uyum olmak kurulan, muhafaza ve bir eşgüdümlü moda1,2‘ serbest bırakmak. Uyum S aşamasında kurulur ve kız kardeşi tutun fiziksel bağlantıları oluşturan cohesin tarafından karmaşık, aracılık ettiği chromatids birlikte. Mayoz, uyum bir crossover için distal, aynı zamanda rekombinant homologs bir arada tutmak için çalışır ve bu fiziksel ilişki uygun yönlendirmeyi sağlamaya yardımcı olur, metafaz üzerinde bivalent (şekil 1)3,4, iğ 5. Serbest bırakmak-in kol uyum anafaz, ters iğ Polonyalılar için ayırmak homologs sağlar. Ancak, kol uyum ise zamanından önce kayıp rekombinant homologs onların fiziksel bağlantı kesilirse, rastgele, hangi aneuploid gametler (şekil 1) neden olabilir ayırmak.
İnsan yumurta, kromozom segregasyon hataları Düşükler ve doğum kusurları, Down sendromu6gibi önde gelen neden olan ve onların insidansı katlanarak maternal yaş7ile artar. Kardeş Kromatit uyum içinde fetal yumurta kurulur ve segregasyonun rekombinasyon doğumdan önce tamamlanır. Yumurta sonra tutuklama orta profaz ben yumurtlama kadar ve bu tutuklama sırasında rekombinant homologs devam eden fiziksel Derneği kardeş Kromatit uyum dayanır. Bu nedenle, mayoz ve normal gebelik sonuçları sırasında doğru segregasyon gerektirir uyum 50 yıl kadar olduğu gibi kalır.
Uyum insan yumurta uzun süreli segregasyonun tutuklanması sırasında erken kaybı maternal yaş etkisi katkıda bulunmak için önerilen ve kanıt birkaç satırlık bu hipotez8,9çekmek için. Ancak, insan yumurta segregasyonun uyum eğitim sorunları göz önüne alındığında, bu olayın bizim anlayış çok fazla model organizmalar5,10,11,12, kullanımına dayanıyor 13,14,15.
Drosophila melanogaster yumurta segregasyonun uyum ve kromozom segregasyon çalışma için birçok avantaj sunar. Basit bir genetik tahlil bir döl aneuploid gamet kurtarmak ve Xkalitesini ölçmek sağlar-kromozom segregasyon büyük ölçekli11,16,17. Ayrıca, bir de ben kol uyum11,18, Prematüre kaybı ile tutarlı bir fenotip mayoz sırasında rekombinant homologs missegregate çünkü kromozom segregasyon hataları ortaya olup olmadığını belirlemek 19. Drosophila yumurta segregasyonun uyum durumunu gözlem yeri de Floresans in situ hibridizasyon (balık) kullanarak doğrudan. Her ne kadar floresan oligonucleotides bu tekrarlayan uydu serileri melezlemek için bir on yıl içinde pericentromeric uyum olgun Drosophila yumurta4,20, kol analizini izlemek için kullanılmış uyum çok daha zor olmuştur. Görselleştirme kol uyum devleti tek kopya büyük bir bölgeye yayılan bir sonda dizileri ve kol uyum yok olduğunda görünür sinyaller bireysel kız kardeşi için chromatids neden yeterince parlak gerektirir. Buna ek olarak, oosit fiksasyon koşulları ve etiketli DNA’lar boyutunu penetrasyon21 büyük olgun Drosophila oosit (200 µm geniş 500 µm uzun tarafından) içine kolaylaştırmak gerekir. Son zamanlarda, bir kol başarıyla yoklamaydı kullanılan görselleştirmek için Drosophila oosit chromatids anafaz sırasında ben, ama yazarlar onlar bir sinyal içinde prometafaz-ebil değil bulmak olduğunu ifade veya metafaz yumurta22tutuklandı. Burada Xüretimi için detaylı bir protokol sağlar-kromozom kol balık probları ve bizi kardeş Prematüre kaybı için Kromatit uyum içinde prometafaz tahlil için ben ve metafaz sağladı oosit hazırlanması koşulları ben yumurta. Bize segregasyonun uyum bakımı için gerekli olan gen ürünleri tanımlamak etkinleştirdiyseniz, bu teknikler, kardeşi için tahlil başkalarına sağlayacak Kromatit uyum kusurları farklı genotip olgun Drosophila yumurta içinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Balık kullanımını değerlendirmek için kol uyum içinde prometafaz durumunu ben ve metafaz probları ben Drosophila yumurta Drosophila mayoz alanında önemli bir gelişme olduğunu. Tarihsel olarak, Drosophila araştırmacılar erken kol uyum olgun yumurta11,18,19kaybı anlaması için genetik testler için sınırlı olmuştur. Şimdi, burada sunulan yöntemleri ile doğrudan balık kullanarak k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH Grant Sharon E. Bickel için ödül GM59354 tarafından desteklenmiştir. Huy s. Nguyen floresan kol probları, Ann Lavanway confocal mikroskobu ile ilgili yardım ve J. Emiliano Reed teknik yardım için oluşturmak için protokol gelişmekte olan yardım için teşekkür. Ayrıca çok sayıda meslektaşları için yararlı tartışmalar ve tavsiye Drosophila toplumda teşekkür ediyoruz.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Altro | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
Riferimenti
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetica. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetica. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
