Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes
Summary
이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.
Abstract
인간에서는, oocytes에서 염색체 분리 오류 유산 및 기형 아 출산의 대부분에 대 한 책임이 있습니다. 또한, 여자 나이, 그들 마음속에 aneuploid 태아는 극적으로 증가 하 고이 현상의 위험 모성 연령 효과로 알려져 있다. Meiotic 분열 동안 정확한 염색체 분리에 대 한 요구 사항 중 하나는 자매의 유지 보수 oocytes 경험 확장된 의향 기간 chromatid 단결력. 인간 및 모형 유기 체에서 cytological 증거 meiotic 단결력 노화 과정 동안 악화 나왔다. 또한, 인간의 oocytes에서 분리 오류는 감수 분열 중 가장 널리 퍼진 나 팔 단결력의 조 손실와 일치. 모델 생물의 사용은 기초가 단결력의 연령에 따라 손실 메커니즘을 탈피 중요 합니다. 초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집력의 규칙을 공부에 대 한 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 최근까지, 유전 시험만 팔 응집력 oocytes 다른 genotypes 또는 다른 실험 조건에서의 손실에 대 한 분석 결과를 사용할 수 없었습니다. 여기, 상세한 프로토콜 형광에서 제자리에서 사용 하기 위한 교 잡 (물고기)을 직접 시각화 결함 prometaphase 팔 응집력에 나 고 분열 초파리 oocytes를 체포 하는 제공 됩니다. X 염색체의 원심 팔 hybridizes를 물고기 프로브를 생성 하 여 수집 하는 confocal Z 스택 연구원 수 3 차원에서 개별 물고기 신호의 수를 시각화 하 고 자매 여부 결정 chromatid 무기 분리. 설명한 팔 단결력 결함 초파리 oocytes의 수백에 계량을 가능 하 게. 따라서,이 방법은 단결력 유지 보수 뿐만 아니라 노화 과정의 죽음으로 이어질 요인에 기여 하는 메커니즘을 조사는 중요 한 도구를 제공 합니다.
Introduction
유사 분열, 감수 분열 동안 염색체의 적절 한 분리 필요 그 자매 chromatid 단결력, 유지, 설립 될와 조정된 패션1,2에 발표. 단결력 S 단계 설정 되 고 복잡 한, 자매는 실제 관계를 형성 하는 cohesin에 의해 중재 chromatids 함께. 감수 분열에서 결합 한 크로스 오버를 원심 또한 함께 재조합 homologs를 기능과이 실제 협회를 통해 올바른 방향이는 분열에의 나는 (그림 1)3,4, 스핀 들 5. 팔의 릴리스 anaphase에 응집력 나 반대 스핀 들 극을 분리 하는 homologs 수 있습니다. 그러나, 팔 단결력은 경우 중간, 손실 재조합 homologs 그들의 물리적 연결을 잃게 되며 임의로, 분리는 aneuploid gametes (그림 1)에서 발생할 수 있습니다.
인간의 oocytes에서 염색체 분리에 오류 유산 및 기형 아 출산, 다운 증후군6, 등의 주요 원인이 되며 그들의 발생 산 모 나이7기 하 급수적으로 증가. 자매 chromatid 단결력 태아 oocytes에서 설정 되 고 meiotic 재결합 출생 하기 전에 완료 됩니다. Oocytes 다음 체포 중간 의향에 나 배 란까지 고이 체포 하는 동안, 재조합 homologs의 지속적인된 물리적 협회 의존 자매 chromatid 단결력. 따라서, 감수 분열과 정상 임신 결과 정확한 분리 결합 최대 5 년간 그대로 유지 해야 합니다.
인간의 oocytes의 장기간된 meiotic 체포 중 응집 조 손실 모성 연령 효과에 기여할 제안 되었습니다와 증거의 여러 줄이 가설8,9를 지원 합니다. 그러나,이 현상의 우리의 이해의 대부분 모델 생물5,10,,1112, 를 사용 하 여 의존 인간의 oocytes meiotic 응집력의 과제를 감안할 때, 13,,1415.
초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집과 염색체 분리의 연구에 대 한 수많은 이점을 제공합니다. 간단한 유전자 분석 결과 수 aneuploid gametes에서 자손을 복구 하 고 X의 충실도 측정-대규모11,,1617에 염색체 분리. 또한, 하나 또한 나 팔 단결력11,18, 의 조 손실에 일치 하는 표현 형 감수 분열 시 재조합 homologs missegregate 때문에 염색체 분리 오류 발생 여부를 결정할 수 있습니다 19. 초파리 oocytes meiotic 응집력의 상태 관찰은 또한 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 직접. 비록 반복적인 위성 시퀀스에 교배 하는 형광 oligonucleotides 사용 되었습니다 10 년 이상 모니터링 성숙 초파리 oocytes4,20, 팔의 분석에서에서 pericentromeric 결합 하 단결력은 더욱 어려운 되었습니다. 팔 단결력의 상태 시각화 단일 복사본의 큰 영역에 걸쳐 프로브 시퀀스 이며 충분히 밝은 결과 개별 여동생에 대 한 표시 신호 chromatids 팔 단결력은 결 석 하는 경우 필요 합니다. 또한, oocyte 고정 조건 및 레이블이 지정 된 DNAs의 크기 큰 성숙한 초파리 oocyte (200 µ m 넓은 500 µ m 길이 의해)에 침투21 를 촉진 해야 합니다. 최근, 한 팔 조사는 성공적으로 활용, 하지만 저자 anaphase 동안 초파리 oocyte chromatids를 시각화 하기 위해 명시 된 그들은 prometaphase에 신호를 감지 하지 못했습니다 또는 분열 oocytes22를 체포. 여기 우리는 X의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제공-염색체 팔 물고기 조사 조건과 oocyte 준비 나 하 고 분열 chromatid 응집력 prometaphase 언 니의 조기 상실에 대 한 분석 결과 허용 난 oocytes. Meiotic 단결력의 유지 보수에 필요한 유전자 제품을 사용, 이러한 기술을 동생에 대 한 분석 결과를 다른 수 chromatid 단결력 다른 genotypes의 성숙한 초파리 oocytes에 결함.
Protocol
Representative Results
Discussion
물고기를 사용 하 여 나 고 분열 prometaphase 팔 응집력의 상태를 평가 하기 위해 프로브 나 초파리 oocytes 초파리 감수 분열의 분야에서 중요 한 발전 이다. 역사적으로, 초파리 연구 성숙 oocytes11,,1819팔 응집력의 조 손실 유추를 유전자 검사로 제한 되었습니다. 자, 여기에 제시 된 방법으로 팔 단결력의 상태 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 샤론 E. 강사에 게 수 여 하는 NIH 그랜트 GM59354에 의해 지원 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 앤 Lavanway와 기술 지원에 대 한 제이 에밀리 리드 형광 팔 프로브를 생성 하기 위한 프로토콜을 개발에 도움에 감사 위이 Q. 응웬 하 고. 우리는 또한 유용한 토론 및 조언을 위한 초파리 커뮤니티에서 수많은 동료를 감사합니다.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Altro | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
Riferimenti
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