सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति का प्रयोग करते हुए Prometaphase और Metaphase में आर्म सामंजस्य की स्थिति पर नजर रखने के लिए मैं Drosophila अंडाणुओं
Summary
इस पांडुलिपि एक्सगुणसूत्र बांह जांच और सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति प्रदर्शन पैदा करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करने के लिए prometaphase और metaphase में बहन chromatid सामंजस्य की स्थिति की जांच मैं गिरफ्तार Drosophila अंडाणुओं । यह प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है कि meiotic आर्म सामंजस्य अलग पादी में बरकरार है या बाधित है ।
Abstract
मनुष्यों में गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों अंडाणुओं में गर्भपात और जंम दोष के बहुमत के लिए जिंमेदार हैं । इसके अलावा, महिलाओं की उंर के रूप में, एक aneuploid भ्रूण गर्भ धारण के अपने जोखिम नाटकीय रूप से बढ़ जाती है और इस घटना को मातृ आयु प्रभाव के रूप में जाना जाता है । meiotic डिवीजनों के दौरान सही गुणसूत्र अलगाव के लिए एक आवश्यकता विस्तारित दौर अवधि के दौरान बहन chromatid सामंजस्य का रखरखाव है कि अंडाणुओं अनुभव । दोनों मनुष्यों और मॉडल जीवों में कोशिकाविज्ञान सबूत से पता चलता है कि meiotic सामंजस्य उंर बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान खराब करता है । इसके अलावा, मानव अंडाणुओं में अलगाव त्रुटियों अर्धसूत्रीविभाजन मैं, एआरएम सामंजस्य के समय से पहले नुकसान के अनुरूप के दौरान सबसे अधिक प्रचलित हैं । मॉडल जीवों के उपयोग तंत्र है कि आबाद उंर सामंजस्य के आश्रित नुकसान को खंडित करने के लिए महत्वपूर्ण है । Drosophila melanogaster अंडाणुओं में meiotic सामंजस्य के नियमन का अध्ययन करने के लिए कई लाभ प्रदान करता है । हालांकि, हाल ही में जब तक, केवल आनुवंशिक परीक्षण अलग पादी के अंडाणुओं में या विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत हाथ सामंजस्य के नुकसान के लिए परख के लिए उपलब्ध थे । यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए सीधे prometaphase में हाथ सामंजस्य में दोषों की कल्पना करने के लिए प्रदान की जाती है मैं और metaphase मैं Drosophila अंडाणुओं गिरफ्तार कर लिया । एक मछली जांच है कि एक्स गुणसूत्र के बाहर की बांह और फोकल जेड के ढेर का संग्रह करने के लिए hybridizes पैदा करके, एक शोधकर्ता तीन आयामों में व्यक्तिगत मछली संकेतों की संख्या कल्पना और निर्धारित कर सकते है कि क्या बहन chromatid हथियार है अलग. रेखांकित प्रक्रिया यह संभव है कि Drosophila अंडाणुओं के सैकड़ों में हाथ सामंजस्य दोष यों तो बनाता है । जैसे, इस विधि तंत्र है कि सामंजस्य रखरखाव के लिए योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कारकों है कि उंर बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान अपने निधन के लिए नेतृत्व की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
बँटवारा और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान गुणसूत्रों के उचित अलगाव की आवश्यकता है कि बहन chromatid सामंजस्य स्थापित किया, बनाए रखा, और एक समंवित फैशन1,2में जारी की । सामंजस्य एस चरण के दौरान स्थापित किया गया है और cohesin जटिल है, जो शारीरिक संबंध है कि बहन chromatids एक साथ पकड़ रूपों द्वारा मध्यस्थता है । अर्धसूत्रीविभाजन में, सामंजस्य एक अंतरराष्ट्रीय भी कार्य करने के लिए बाहर संयोजक homologs एक साथ पकड़ और इस शारीरिक एसोसिएशन में मदद करता है bivalent मैं धुरी (चित्रा 1)3,4पर metaphase का उचित अभिविंयास सुनिश्चित करने के लिए, 5. anaphase में एआरएम सामंजस्य के रिलीज मैं homologs विपरीत धुरी डंडे को अलग करने की अनुमति देता है । हालांकि, अगर एआरएम सामंजस्य समय से पहले खो दिया है, संयोजक homologs अपने शारीरिक कनेक्शन खो देंगे और बेतरतीब ढंग से अलग है, जो aneuploid gametes में परिणाम कर सकते है (चित्रा 1) ।
मानव अंडाणुओं में, गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों गर्भपात और जंम दोष के प्रमुख कारण हैं, जैसे नीचे सिंड्रोम6, और उनकी घटना मातृ आयु7के साथ तेजी से बढ़ जाती है । सिस्टर chromatid सामंजस्य भ्रूण अंडाणुओं में स्थापित है और meiotic पुनर्संयोजन के पहले जंम पूरा हो गया है । अंडाणुओं तो मध्य दौर में गिरफ्तारी मैं ovulation तक और इस गिरफ्तारी के दौरान, संयोजक homologs के जारी शारीरिक एसोसिएशन बहन chromatid सामंजस्य पर निर्भर करता है । इसलिए, अर्धसूत्रीविभाजन और सामांय गर्भावस्था के परिणामों के दौरान सटीक अलगाव की आवश्यकता है कि सामंजस्य के लिए पांच दशकों तक बरकरार रहेगा ।
मानव अंडाणुओं के लंबे समय तक meiotic गिरफ्तारी के दौरान सामंजस्य के समयपूर्व नुकसान के लिए मातृ आयु प्रभाव और सबूत की एकाधिक पंक्तियों का समर्थन इस परिकल्पना8,9में योगदान करने का प्रस्ताव किया गया है । हालांकि, मानव अंडाणुओं में meiotic सामंजस्य अध्ययन की चुनौतियों को देखते हुए, इस घटना की हमारी समझ के बहुत मॉडल जीवों के उपयोग पर निर्भर करता है5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster अंडाणुओं meiotic सामंजस्य और गुणसूत्र अलगाव के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं । एक साधारण आनुवंशिक परख एक aneuploid gametes से संतान को ठीक करने और एक बड़े पैमाने पर11,16,17पर एक्सगुणसूत्र अलगाव की निष्ठा को मापने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, एक यह भी निर्धारित कर सकते है कि गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों उठता है क्योंकि संयोजक homologs अर्धसूत्रीविभाजन मैं, एक phenotype है कि हाथ की समयपूर्व नुकसान के साथ संगत है के दौरान अलगाव सामंजस्य11,18, 19. Drosophila अंडाणुओं में meiotic सामंजस्य के राज्य का प्रत्यक्ष अवलोकन भी सीटू प्रतिदीप्ति (मछली) में संकरण का प्रयोग संभव है. हालांकि फ्लोरोसेंट oligonucleotides है कि दोहराए उपग्रह दृश्यों के लिए संकरण के लिए इस्तेमाल किया गया है एक दशक से अधिक के लिए परिपक्व Drosophila अंडाणुओं4,20, एआरएम के विश्लेषण में pericentromeric सामंजस्य मॉनिटर सामंजस्य ज्यादा चुनौतीपूर्ण रहा है । एआरएम सामंजस्य के राज्य के दृश्य एक जांच की आवश्यकता है कि एक प्रतिलिपि दृश्यों का एक बड़ा क्षेत्र फैलाती है और काफी उज्ज्वल व्यक्तिगत बहन chromatids के लिए दिखाई संकेतों में परिणाम जब बांह सामंजस्य अनुपस्थित है । इसके अलावा, oocyte निर्धारण शर्तों और लेबल DNAs के आकार बड़े परिपक्व Drosophila oocyte (२०० µm चौड़ा द्वारा ५०० µm लंबे) में प्रवेश21 की सुविधा होनी चाहिए । हाल ही में, एक हाथ जांच सफलतापूर्वक anaphase मैं के दौरान Drosophila oocyte chromatids कल्पना का उपयोग किया गया था, लेकिन लेखकों ने कहा कि वे prometaphase या metaphase में एक संकेत का पता लगाने मैं22अंडाणुओं गिरफ्तार नहीं कर सका । यहां हम X-गुणसूत्र हाथ मछली जांच और oocyte तैयारी की स्थिति है कि हम prometaphase मैं और metaphase मैं अंडाणुओं में बहन chromatid सामंजस्य के समय से पहले नुकसान के लिए परख करने की अनुमति दी है की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इन तकनीकों, जो हमें सक्षम है जीन उत्पादों है कि meiotic सामंजस्य के रखरखाव के लिए आवश्यक है की पहचान करने के लिए, दूसरों की अनुमति होगी बहन chromatid सामंजस्य दोषों के लिए परख करने के लिए विभिंन Drosophila के परिपक्व अंडाणुओं पादी में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मछली जांच का उपयोग prometaphase में आर्म सामंजस्य की स्थिति का आकलन करने के लिए मैं और metaphase मैं Drosophila अंडाणुओं Drosophila अर्धसूत्रीविभाजन के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उन्नति है. ऐतिहासिक, Drosophila शोधकर्ताओं आन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH ग्रांट GM59354 ने शेरोन ई. Bickel को सम्मानित कर समर्थन किया था. हम Huy Q. गुयेन फ्लोरोसेंट बांह जांच पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने में सहायता के लिए धंयवाद, फोकल माइक्रोस्कोप के साथ मदद के लिए एन Lavanway, और जे Emiliano रीड तकनीकी सहायता के लिए । हम भी Drosophila समुदाय में सहायक विचार विमर्श और सलाह के लिए कई सहयोगियों को धंयवाद ।
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Altro | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
Riferimenti
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