Использование флюоресценции в Situ гибридизация (рыбы) для контроля состояния руку сплоченности в Прометафаза и метафаза я дрозофилы ооцитов
Summary
Эта рукопись представляет подробный метод для генерации X-хромосомы руку зондов и исполняющая флуоресценции в situ гибридизация (рыбы) для изучения состояния сестра хроматиды сплоченности в Прометафаза и метафаза я арестован Дрозофила ооцитов. Этот протокол предназначен для определения, является ли meiotic руку сплоченности нетронутыми или нарушена в различных генотипов.
Abstract
В организме человека хромосома сегрегации ошибки в ооциты отвечают за большинство выкидышей и врожденных дефектов. Кроме того, как возраст женщины их риск зачатие что анеуплоидных плода резко возрастает и это явление называется эффект возраст матери. Одним из требований для точного хромосома сегрегации во время meiotic отделов является поддержание сестра хроматиды сплоченности в период расширенной профаза, что опыт ооцитов. Цитологические доказательства как людей, так и модельные организмы свидетельствует о том, что meiotic сплоченности ухудшается во время процесса старения. Кроме того, ошибки сегрегации в человеческой яйцеклетки являются наиболее распространенными во время мейоза I, в соответствии с преждевременной потери сцепления руку. Использование модели организмов имеет решающее значение для распутывая механизмы, которые лежат в основе возрастные потери сцепления. Drosophila melanogaster предлагает ряд преимуществ для изучения регуляции meiotic сплоченности в ооцитов. Однако до недавнего времени только генетические тесты были доступны для анализа потери руку сплоченности в ооциты различных генотипов или в различных экспериментальных условиях. Здесь подробный протокол предоставляется для использования флуоресценции в situ гибридизация (рыба) непосредственно визуализировать дефекты в руку сплоченности в Прометафаза я и метафаза я арестован дрозофилы ооцитов. Генерации рыбы зонд, который скрестил на дистальном плече хромосомы X и собирая конфокальный Z стеки, исследователь может визуализировать количество отдельных сигналов рыбы в трех измерениях и определить, является ли сестра хроматиды оружие отдельно. Процедура, изложенная делает возможным количественно руку сплоченности дефекты в сотни дрозофилы ооцитов. Таким образом этот метод обеспечивает важный инструмент для изучения механизмов, которые способствуют сплоченности обслуживания, а также факторы, которые приводят к ее гибели во время процесса старения.
Introduction
Надлежащего разделения хромосом во время мейоза и митоз требует что сестра хроматиды сплоченности установлено, поддерживал и выпущен в скоординированно1,2. Сплоченности устанавливается на этапе S и опосредовано когезинов комплекс, который образует физических связей, которые держат сестра chromatids вместе. В мейоз, сплоченность, дистальнее кроссовер также функции провести рекомбинантных гомолог вместе и это физическое объединение помогает обеспечить надлежащей ориентации из двухвалентного на метафаза я шпинделя (рис. 1)3,4, 5. Освобождении рычага сцепления в анафазе позволяет гомолог отделить к противоположным полюсам шпинделя. Однако если рука сплоченности потерял преждевременно, рекомбинантных гомолог будет терять их физическое соединение и разбить случайным образом, что может привести к анеуплоидных гамет (рис. 1).
В человеческих яйцеклеток ошибки в хромосоме сегрегации являются основной причиной выкидышей и врожденных дефектов, таких как синдром Дауна6, и их заболеваемость возрастает экспоненциально с возрастом матери7. Сестра хроматиды сплоченности устанавливается в плода ооцитов и meiotic рекомбинации завершена до рождения. Ооциты затем арестовать в середине профазе I до овуляции и во время этого ареста, продолжение физической ассоциации рекомбинантных гомолог опирается на сестра хроматиды сплоченности. Таким образом Точная сегрегации во время мейоза и исходы нормальной беременности требуют, что сплоченность остаются нетронутыми до пяти десятилетий.
Преждевременная потеря сцепления во время длительного ареста meiotic человеческих яйцеклеток было предложено вносить эффект возраст матери и несколько строк доказательства поддержки эта гипотеза8,9. Однако, учитывая проблемы изучения meiotic сплоченности в человеческих яйцеклеток, большая часть нашего понимания этого явления основывается на использовании модели организмов5,10,11,12, 13,14,15.
Ооциты Drosophila melanogaster предлагают многочисленные преимущества для изучения meiotic сплоченности и хромосомы сегрегации. Простой генетического анализа позволяет восстановить потомства от анеуплоидных гамет и измерить точность X-хромосомы сегрегации на больших масштабах11,16,17. Кроме того, может также определить ли хромосома сегрегации ошибки возникают потому, что рекомбинантных гомолог missegregate во время мейоза я, фенотип, что согласуется с преждевременной потери руку сплоченности11,18, 19. прямые наблюдения состояния meiotic сплоченности в дрозофилы яйцеклеток также возможно с помощью флуоресценции в situ гибридизация (рыбы). Хотя флуоресцентные олигонуклеотидов который гибридизируйте Спутниковое повторяющихся последовательностей были использованы для более десяти лет для мониторинга pericentromeric сплоченности в зрелых дрозофилы ооциты4,20, анализ руки сплоченность был гораздо более сложным. Визуализация состояния руку сплоченности требует зонд, который охватывает большой регион одной копии последовательностей и достаточно ярким, чтобы привести к видимых сигналов для отдельных сестра chromatids, когда рука сплоченности отсутствует. Кроме того условия фиксации ооцитов и размер помечены ННО должны способствовать проникновения21 в больших зрелых ооцитов дрозофилы (200 мкм длиной 500 мкм). Недавно, и рука зонд был успешно использован визуализировать дрозофилы ооцитов chromatids в анафазе я, но авторы заявили, что они не могут обнаружить сигнал в Прометафаза или метафаза я арестован ооциты22. Здесь мы предоставляем подробный протокол для поколения X-хромосомы руки, рыбы зонды и ооцитов подготовке условий, которые позволили нам пробирного преждевременной потери сестры хроматиды сплоченности в Прометафаза я и метафаза я ооцитов. Эти методы, которые позволили нам определить продукты гена, которые требуются для поддержания meiotic сплоченности, позволит другим, чтобы проба для сестры хроматиды сплоченности дефекты в зрелых яйцеклеток дрозофилы различных генотипов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование рыбы зонды для оценки состояния руку сплоченности в Прометафаза я и метафаза я дрозофилы яйцеклеток является значительное продвижение в области дрозофилы мейоз. Исторически дрозофила исследователи были ограничены генетические тесты для выведения прежде…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH Грант GM59354 присуждена Шарон E. Bickel. Мы благодарим Huy Q. Nguyen за помощь в разработке протокола для генерации люминесцентные руки зонды, Энн Lavanway за помощь с confocal микроскопии и Дж. Рид Emiliano для оказания технической помощи. Мы также благодарим многочисленных коллег в общине дрозофилы полезные обсуждения и консультации.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Altro | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
Riferimenti
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetica. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetica. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
