쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

Summary

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

Abstract

재생 의학 조건 전통적인 치료에 도전 하는 새로운 대안을 제공 합니다. 정도와 종에 걸쳐 tendinopathy의 사망률이 조직의 한정 된 치료 속성 결합, 세포 치료에 대 한 검색 메시지가 있고 그들의 효능을 연구 실험 모델의 개발을 추진. 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSC UCM)는 매력적인 후보 때문에 풍부 하 고, 수집, 윤리적인 우려 및 기형종 형성의 위험 회피 아직 원시적인 배아 줄기 세포를 더 밀접 하 게 닮은 쉽게 보다 성인 조직 유래 MSCs 상당한 관심은 회전 타원 체 형성을 통해 MSCs의 재산을 강화 하는 전략으로 키토 산에 집중 했다. UCM-MSCs을이 종이 세부 기법 키토 산 필름 spheroids를 준비 하 고 표면 마커 식에 회전 타원 체 형성의 효과 분석. 따라서, 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델의 창조는 UCM MSC spheroids 키토 산 필름 형성의 vivo에서 이식에 대 한 설명 되어 있습니다. 아니 합병증 관찰 되었다 병 적 상태에 관하여 연구에서 스트레스 상승 효과, 또는 조직 감염. 7 일 운영된 쥐의 총 기능 점수 정상 쥐 보다 낮은 했지만 수술 후 28 일 이내 정상으로 돌아왔다. 조직 치유의 조직학 점수 7 일 평가 처리 결함에 응고 이물질 반응, 그리고 28 일에 치료 진행의 부재의 존재를 확인 했다. 이 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 각 쥐에는 내부 통제의 창조를 통해 간 개별 변형 제어, 수용 병 적 상태와 관련 된 되었고 치료 힘 줄과 치료의 차이점의 탐지를 허용.

Introduction

힘 줄 부상 종¹에 걸쳐 상당한 통증과 근육 위축 증의 가장 일반적인 원인 중 하나입니다. 수의학, 경주 말에 모든 상해의 82 %musculoskeletal 시스템을 포함 하 고 그의 46%에 영향을 미칠 힘 줄과 인 대^2,3말에 특별 한 관심의 힘 줄 및 인 대 부상 있습니다. 흉터 조직 형성과 치료 힘 줄의 biomechanical 속성에 영향을 미치는 flexor의 힘 줄 부상; 후 운동 사용에 반환에 대 한 경비 예 후를 설명 한다 다시 부상 발생에 2 년 이내 최대 말의 67^%4신중 하 게 취급 합니다. 재생 의학 도전 전통적인 치료 조건에 새로운 대안을 제공 합니다. 자가 줄기 세포 치료 몇 가지 고무적인 결과^5,6 생산 하지만 조직 컬렉션, 지연 처리/프로그래밍으로 인해 셀, 행정과의 영향와 관련 된 병 적 상태에 의해 제한 되는 줄기의 속성 (예: 연령) 환자의 건강 상태^7,8세포. 이러한 제한은 상용 해서도 수용자 줄기 세포를 조사 근거를 제공 합니다. 그들은 윤리적 문제 및 기형종의 배아 줄기 세포와 관련 된 위험을 회피 하기 때문에 태아 adnexa 파생 셀 매력적인 후보자 이다. 태아 adnexa 가운데 탯 매트릭스 (UCM)와 튼의 젤리 라는 풍부 하 고 수집 하기 쉬운입니다.

셀 소스에 stemness 강화 allogenic 재생 의학을 위한 세포 은행 확립에 필수적 이다. 기능 관점에서 stemness 자체 갱신 및 다중 계보 분화⁹에 대 한 가능성으로 정의할 수 있습니다. Stemness의 증거 분석, 유전자 마커 Oct4, Sox2, 및 Nanog⁹의 식 함께 확산 및 감 별 법에 의존합니다. 한 전략 stemness 향상을 void 필러와 강화 확산 및 UCM MSCs의 차별화로 생체 재료의 사용에 의존 합니다. 이 방법은 유도 만능 세포로 성숙 세포를 재 설 정할 transcriptional 요인의 조작에 관한 우려를 제거 합니다. 생체 줄기 세포에 대 한 잠재적인 운반대로 간주, 중 키토 산 생체 적합성과 분해성¹⁰매력적 이다. 이 자연 aminopolysaccharide 카이, 두 번째 가장 풍부한 천연 다 당 류 주로 조개¹⁰의 subproduct로 얻은 알칼리 성 deacetylation에 의해 형성 된다. 우리 이전에 MSCs 및 키토 산 건설 기계 사이의 상호 작용을 조사 하 고 spheroids^{11,12,13,,1415,} 의 형성 관찰 ¹⁶. 우리는 또한 키토 산 행렬^{12,13,14,15,,1617, chondrogenesis의 우수성에 보고 18}. 최근에, 2 개의 독립적인 연구 지방 조직에 의해 spheroids 형성을 설명 하 고 태 반 조직 유래 키토 산 영화^19,20에 경작 하는 MSCs. Spheroids의이 형성 뿐만 아니라 stemness, 강화 하지만 또한 생체 내에 이식²⁰후 줄기 세포의 보존을 향상.

정도와 병 종에 걸쳐 tendinopathy의 tendinopathies의 병 태 생리학을 연구 하 고 줄기 세포 주사 등 새로운 치료법을 테스트 실험 모델의 개발 라는 메시지가 있다. 말, 콜라 유도 염증이 생길 수도 힘 줄 수리²¹에서 MSCs를 사용 하 여 효능을 입증 하는 일반적인 모델입니다. 이 접근의 관련성, 주사는 급성 염증 성 변화를 일으킬, 임상 tendinopathies 만성에서 일반적으로 발생 하는 반면 팽팽하게^22,23. 또한, 힘 줄 질환의 화학 유도 치료 응답을 유도 하 고 임상의 경우^22,23에 장애인된 치유 과정을 복제 하지 않습니다. 표면 디지털 flexor의 힘 줄의 세그먼트의 절단 말²⁴에 염증이 생길 수도의 외과 모델로 설명 하고있다. 더 최근에, 최소로 침략 접근 표면 디지털 flexor의 힘 줄²⁵의 중앙 코어를 외상 성 손상 제한 하 사용 되었다. 외과 모델 자연 힘 줄 질환으로 이어질 수 있는 손상 만든²⁵의 범위 내에서 재현성 부족 경향이 피로 메커니즘을 시뮬레이션 하지 않습니다. 모델, 병 적 상태 및 힘 줄의 말 모델와 관련 된 비용에 질병 vivo에서 새로운 치료의 평가 대 한 첫 번째 단계로 설치류 모델에 대 한 관심을 정당화 하는 추가 제한이 있습니다.

설치류의 실험 모델의 주요 장점 중 하나 비용과 간 개별 가변성을 제어 하는 기능으로 이루어져 있다. 설치류 그들의 빠른 성장 속도로 인해 다양 한 생리 적인 요인에 관하여 표준화 수 고 상대적으로 짧은 수명을, 변이의 소스를 제한 및 그러므로 차이 감지 하는 데 필요한 동물의 수를 감소. 설치류에 힘 줄 질환을 유도 하는 전략 부분 힘 줄 결함²¹의 외과 생성 뿐만 아니라 화학 유도에 의존 했습니다. 외과 모델 자연 tendinopathies 화학 모델 보다 더 나은 시뮬레이션 수 있습니다 하지만 더 높은 사망률 및 손상 된 힘 줄의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. 그 점에서 쥐 조직 치유의 평가 촉진 함으로써 더 큰 결함의 생성을 허용 하는 그들의 크기가이 모델에 대 한 마우스 보다 더 나은 후보를 보인다. 4 주요 힘 줄 그룹에서 tendinopathies의 실험 연구에서 사용 된 Sprague-Dawley 쥐: 회전자, flexor, 아 킬 레 스, 그리고 슬 개 골 심 줄²⁶. 이 중, 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델은이 힘 줄의 더 큰 크기와²⁷에 액세스의 용이성 때문에 특히. 슬 개 골 힘 줄 tibial tuberosity에 quadriceps 근육을 연결합니다. 이 신 근 메커니즘 내에서 슬 개 골은 sesamoid 뼈는 허벅지 근육의 동작을 지시 하 고 슬 개 골 힘 줄의 인접 정도 구분. 슬 개 골 힘 줄의 인접 하 고 말 초 범위에서 뼈 앵커의 존재 biomechanical 테스트를 지원합니다. 일반적으로 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델 contralateral 그대로 힘 줄 컨트롤^28,29봉사와 일방적인 외과 결점에 의존 합니다. 가장 일반적인 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에서는 contralateral 슬 개 골 힘 줄은 그대로 동안 tibial tuberosity의 삽입에 슬 개 골의 원심 꼭대기에서 슬 개 골 힘 줄의 중앙 부분 (폭에서 1 m m)를 절 개 합니다. 측정 결과의 조직학, 비-파괴적인 biomechanical 테스트 또는 biomechanical 테스트 실패, 초음파 영상, ex vivo 형광 이미징, 총 관찰, 그리고 기능 테스트^{28,30 포함 ,31}. 일방적인 모델 같은 동물 내에서 유사한 상해의 보수 관리와 제안 된 치료의 비교를 허용 하지 않습니다. 마찬가지로, 여러 치료 간의 비교는 별도 동물을 필요합니다. 양자 모델 간 개별 변이 제거 하 고 연구³²에 필요한 동물의 수를 줄일 것 이다. 그러나, 양자 상해 사망률을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 양자 lameness 치료 평가 방해 수 있습니다. 몇 가지 연구 짧게 페리 요원 관리 보다는 오히려 치료의 효과 모델^33,34의 병 적에 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 쥐 하지만 초점에의 사용을 보고합니다.

이 연구의 장기 목표는 UCM MSCs allogenic 이식에 운명의 stemness 그리고 vivo에서 생존을 개량 하는 전략을 개발 하는 것입니다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리 최근 키토 산 영화와 인큐베이션 hypoxic 환경³⁵아래에 spheroids의 형성에 의해 UCM MSCs의 향상 된 stemness을 보고 있다. 이러한 생체 외에서 속성은 관련 된 슬 개 골 힘 줄 결함 조건된 UCM으로 치료의 향상 된 biomechanical 속성-MSCs. 이러한 결과에 기반, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 후보 테스트에 적합 한 것 힘 줄 부상³⁶에 대 한 치료입니다. 연구의 목적은 여기 격리 및 특성화 UCM MSCs의 줄기 세포, 창조 및 양측 슬 개 골 힘 줄 결함, 그리고 수술 후의 치료에 대 한 생물 학적 전달 시스템의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 보고 복구 및 조직 결함 내 치유의 평가 합니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨스턴 대학 보건 과학에 의해 승인 되었습니다. 1. 격리와 말 탯 매트릭스에서 MSCs의 확장 태 반 (임신) 성인 마 레에서 foaling 관찰 후을 aseptically 탯 태에서 분리 합니다. 탯에에서 계속 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1% 페니실린-스 (P/S)와 4 ° C에서 전송 하는 동안 처리까지. 실내 온도 PBS 1%로 두 번 …

Representative Results

현재 연구에서 결과 ± SD (표준 편차)를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 셀 6 mares의 탯에서 고립 되었다 및 표준 또는 키토 산 컨디셔닝에서 각 세포 표면 마커를 표현 하는 격리 된 셀 라인의 비율 비교 했다 프리드먼 테스트와 함께 비패라메트릭 분산 분석으로 반복 측정 한다입니다. 힘 줄 결함 모델 생성 8 쥐 7 일 수술 후 평가 위해 사용 되었다 및 12 쥐 28 일 평가 위해 사용…

Discussion

우리 결국 말에 자연 tendinopathies의 관리에서 후보 접근을 테스트 하는 것 때문에 말 셀이이 프로젝트에 대 한 선정 됐다. 실제로, 말에 힘 줄 부상 있습니다 말 표면 디지털 flexor 및 인간⁴¹킬 사이 생물 학적 유사성 때문에 자연 모델 남자에서 tendinopathy의 매력. 세포 표면 마커 CD44, CD90, CD105, CD34와 MHC II immunophenotyping 세포 치료⁴²에 대 한 국제 학회에서 권장 하는 ?…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable