Evaluering av stilk cellen terapi i bilaterale patellarsenen skade modell i rotter

Summary

Dette dokumentet beskriver forberedelse og evaluering av navlestreng matrix-avledet mesenchymal stamceller spheroids med bilaterale patellarsenen feil modell i rotte. Denne modellen ble var assosiert med en akseptabel sykelighet funnet for å oppdage forskjeller mellom ubehandlede og behandlet sener og mellom to behandlinger testet.

Abstract

Regenerativ medisin skaffer romanen alternativer til forhold som utfordrer tradisjonell behandlinger. Utbredelse og sykelighet av tendinopathy over arter, har kombinert med begrenset helbredende egenskapene til dette vev, bedt om søk etter mobilnettet terapier og drevet utviklingen av eksperimentelle modeller å studere deres effekt. Navlestreng matrix-avledet mesenchymal stamceller (UCM-MSC) er tiltalende kandidater fordi de er rikelig, lett å samle, omgå Etiske bekymringene og risikoen for teratoma dannelse, men ligner primitive embryonale stamceller nærmere enn voksen vev-avledet MSCs. betydelig interesse har fokusert på chitosan som en strategi for å forbedre egenskapene til MSCs gjennom formet formasjon. Dette papiret detaljer teknikker å isolere UCM-MSCs, forberede spheroids på chitosan film, og analysere effekten av formet formasjon på overflaten markør uttrykk. Derfor er etableringen av bilaterale patellarsenen skade modell i rotter beskrevet for i vivo implantasjon av UCM-MSC spheroids dannet på chitosan film. Nei komplikasjon ble observert i studien forhold til sykelighet, stress stigende effekter eller vev infeksjon. Total funksjonelle score på styres rotter i 7 dager var lavere enn vanlig rotter, men tilbake til det normale innen 28 dager etter operasjonen. Histologiske scorene til vev-healing bekreftet tilstedeværelse av en blodpropp i behandlede defekter evalueres på 7 dager, fravær av fremmedlegemer reaksjon, og avansere helbredende på 28 dager. Denne bilaterale patella sene defekt modellen var styrer Inter individuell variasjon via etableringen av en intern kontroll i hver rotten forbundet med akseptabel sykelighet og tillatt påvisning av forskjellene mellom ubehandlet sener og behandlinger.

Introduction

Gjete skaden er en av de vanligste årsakene til betydelig smerte og muskelen atrofi over arter¹. I veterinærmedisin er sene og ligament skader av spesiell interesse for hester, 82% av alle skader i hester involverer bevegelsesapparatet, og 46% av dem påvirke tendons og leddbånd^2,3. Arrvev formasjon påvirker egenskapene biomekaniske helbredet sener og forklarer bevoktet prognosen for retur til atletisk bruk etter bøyer sene skader; Re-skader oppstår innen 2 år i opp til 67% av hestene behandlet konservativt⁴. Regenerativ medisin skaffer romanen alternativer til en tilstand som utfordrer tradisjonell behandlinger. Autologous stilk cellen terapi har produsert noen oppmuntrende resultater^5,6 , men er begrenset av sykelighet forbundet med vev samling, forsinket administrasjon på grunn av behandling/omprogrammere celler og påvirkning av den pasientens helsetilstand (for eksempel alder) på egenskapene til stilk celler^7,8. Disse begrensningene gir en begrunnelse for å undersøke allogene stamceller som en sokkel alternativ. Fosterets H59-avledet celler er tiltalende kandidater fordi de omgå Etiske bekymringene og risikoen for teratoma dannelse tilknyttet embryonale stamceller. Blant fosterets H59 er navlestreng matrix (UCM), også kalt Whartons gelé, rikelig og enkelt å samle.

Uavhengig celle kilden er styrke stemness viktig å etablere en cellen bank allogenic regenerativ medisin. Fra et funksjonelt synspunkt, kan stemness defineres som potensialet for selvtillit fornyelse og flere avstamning differensiering⁹. Bevis på stemness bruker spredning og differensiering analyser, sammen med uttrykk av genet markører Oct4, Sox2, og Nanog⁹. En strategi for å forbedre stemness, avhengig av bruk av biologisk materiale som ugyldige fyllstoff og bærere styrke spredning og differensiering av UCM-MSCs. Dette eliminerer angående manipulering av transcriptional faktorer å omprogrammere modne celler i indusert pluripotent celler. Biologisk materiale betraktet som potensielle stativer for stamceller, er chitosan tiltalende for biocompatibility og nedbrytbarhet¹⁰. Denne naturlige aminopolysaccharide er dannet av alkaliske deacetylation av chitin, det nest mest rikelig naturlig polysakkaridet, hovedsakelig fikk som en subproduct av skalldyr¹⁰. Vi har tidligere undersøkt interaksjoner mellom MSCs og chitosan stillaser og observert dannelsen av spheroids^{11,12,13,14,15, 16}. vi også rapportert om overlegenhet chondrogenesis på chitosan matriser^{12,13,14,15,16,17, 18}. Flere nylig, to uavhengige studier beskrevet spheroids dannelsen av fettvev og morkaken vev avledet MSCs kultivert på en chitosan filmen^19,20. Denne dannelsen av spheroids ikke bare forbedret stemness, men også forbedret oppbevaring av stamceller etter i vivo implantasjon²⁰.

Utbredelse og sykelighet av tendinopathy over arter har bedt om utvikling av eksperimentelle modeller å studere i Patofysiologien ved tendinopathies og teste nye behandlingsformer som stem cell injeksjoner. I hester er collagenase-indusert senebetennelse en felles modell å demonstrere effekt ved hjelp av MSCs i sene reparasjon²¹. Relevansen av denne tilnærmingen er begrenset, injeksjoner forårsake akutt inflammatoriske endringer, mens klinisk tendinopathies vanligvis resultat av kronisk overstrain^22,23. I tillegg kjemiske induksjon av sene sykdom induserer en healing respons og replikerer ikke svekket helbredelsesprosessen i kliniske tilfeller^22,23. Eksisjon av et segment i overfladisk digital bøyer senen har blitt beskrevet som en kirurgisk modell av senebetennelse i hester²⁴. Nylig ble en minimal invasiv tilnærming brukt til å begrense det traumatic skaden til den sentrale kjernen av overfladiske digital bøyer sene²⁵. Kirurgisk modeller ikke etterligne tretthet mekanismen som kan føre til naturlige sene sykdom, og pleier å mangler reproduserbarhet i omfanget av skaden opprettet²⁵. Uansett modell, sykelighet og kostnader knyttet til equine modeller av sene er sykdommer flere begrensninger, som rettferdiggjør interesse gnager modeller som et første skritt i vivo evaluering av romanen terapi.

En av de viktigste fordelene med eksperimentelle modeller i gnagere består av kostnadene og muligheten til å kontrollere Inter-individuelle variasjon. Gnagere kan være standardisert med hensyn til ulike fysiologiske faktorer på grunn av deres raske vekst priser og korte relativt levetid, begrenser kilder til variasjon og derfor redusere antall dyr kreves for å gjenkjenne forskjellene. Strategier for å indusere sene sykdommer i Red har stolt på kjemiske induksjon, men også på kirurgisk etableringen av delvis sene defekter²¹. Kirurgisk modellene kan simulere naturlig tendinopathies bedre enn kjemiske modeller, men kan føre til høyere sykelighet og katastrofal svikt i skadet senen. I den forbindelse synes rotter bedre kandidater enn mus for disse modellene, som deres størrelse gjør etableringen av større feil, og dermed evaluere vev helbredelse. Sprague-Dawley rotter har blitt brukt i eksperimentelle studier av tendinopathies i fire store sene grupper: rotatorcuff, bøyer, Akilles og patellar sener²⁶. Blant disse er modellene som involverer patellar senen spesielt attraktivt på grunn av større størrelsen på dette sene og enkel tilgang til den²⁷. Patellarsenen festes quadriceps muskel til tibial tuberosity. I denne extensor mekanismen er patella en sesamoid bein som leder av quadriceps og delineates proksimale omfanget av patellar senen. Tilstedeværelsen av benete ankere på proksimale og distale omfanget av patellar senen forenkler biomekaniske tester. Modeller som involverer patellar senen vanligvis stole på ensidige kirurgisk feil, med en kontralateral intakt sene som en kontroll^28,29. Den vanligste patellarsenen defekt modellen innebærer excising den sentrale delen (1 mm i bredde) av patellarsenen fra den distale toppen av patella for innsetting av tibial tuberosity, mens den kontralateral patellarsenen er intakt. Tiltak av resultatene har inkludert histology, ikke-destruktiv biomekaniske testing eller biomekaniske testing til svikt, ultralyd imaging, ex vivo fluorescens bildebehandling, brutto observasjon og funksjonelle tester^{28,30 ,31}. Ensidig modeller tillater ikke sammenligning av en foreslått behandling med konservative ledelse av en lignende skader samme dyret. Tilsvarende krever sammenligning mellom flere behandlinger separate dyr. En bilaterale modell ville eliminere Inter enkeltvarianter og redusere antall dyr kreves for en studie³². Men bilaterale skader kan øke sykelighet og bilaterale klagesang kunne vanskeliggjøre behandling evaluering. Noen studier rapporterer kort bruk av bilaterale patellarsenen feil i rotter men fokus på effekten av behandlinger i stedet for peri-operative ledelse og sykelighet av modell^33,34.

Denne studien langsiktige målet er å utvikle en strategi for å forbedre stemness og i vivo overlevelse av UCM-MSCs skal allogenic transplantasjon. For å oppnå dette målet, har vi nylig rapportert forbedret stemness av UCM-MSCs ved dannelsen av spheroids på chitosan film og inkubasjon under hypoxic miljø³⁵. Disse i vitro egenskapene var assosiert med bedre biomekaniske egenskaper patellarsenen feil behandlet med betinget UCM-MSCs. basert på disse resultatene, rotte bilaterale patellarsenen feil modell synes egnet til å teste kandidat behandlinger for sene skader³⁶. Formålet med studien rapporterte her er å gi detaljert protokoller for isolering og karakterisering av UCM-MSCs, utarbeidelse av en biologisk leveringssystem for stamceller, opprettelse og behandling av bilaterale patella sene feil og post-operativ utvinning og evaluering av vev helbredelse inne feil.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Western University of Health Sciences. 1. isolering og utvidelse av MSCs i Equine navlestreng matrisen Få morkaken fra en voksen mare (gravid) når observert foaling og tas aseptisk isolere navlestrengen fra morkaken. Hold navlestrengen i fosfat bufret saltvann (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) på 4 ° C under overføring til behandling. Vask navlestrengen t…

Representative Results

I denne studien, er resultatene presentert som betyr ± SD (standardavvik). Cellene ble isolert fra navle snorer av 6 mares, og andelen isolert cellelinjer uttrykke hver celle overflaten indikator under standard eller chitosan condition ble sammenlignet med en Friedman test, som en ikke-parametriske variansanalyse med gjentatt tiltak. For oppretting av sene feil modell 8 rotter brukes av 7 dager etter operasjonen vurdering og 12 rotter ble brukt til 28 dager vurdering. Resultatene av funk…

Discussion

Equine celler ble valgt for dette prosjektet fordi vi til slutt skal teste kandidat tilnærminger i forvaltningen av naturlige tendinopathies i hester. Sene skader i hester er faktisk tiltalende som naturlig modeller av tendinopathy mann gitt biologiske likhet mellom equine overfladisk digital bøyer og akillessene i mennesker⁴¹. Cellen overflate markører CD44, CD90, CD105, CD34 og MHC-II ble valgt for immunophenotyping av celler, i samsvar med kriteriene anbefalt av internasjonale samfunnet for …

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable