Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Summary

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Abstract

Medicina regenerativa fornece novas alternativas às condições que desafiam os tratamentos tradicionais. A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda a espécie, combinada com as propriedades curativas limitadas deste tecido, ter solicitado a busca de terapias celulares e impulsionou o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a sua eficácia. Cordão umbilical matriz-derivados mesenquimais células-tronco (UCM-MSC) são candidatos atraentes porque eles são abundantes, fácil de coletar, contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma, ainda assemelham-se a células-tronco embrionárias primitivas mais pròxima do que adulto derivado de tecido MSCs. significativo interesse centrou-se na quitosana como uma estratégia para melhorar as propriedades do MSCs através da formação de esferoide. Este papel detalhes técnicas para isolar a UCM-MSCs, preparar esferoides no filme de quitosana e analisar o efeito da formação de esferoide na expressão do marcador de superfície. Consequentemente, a criação de um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos é descrita para implantação na vivo de esferoides UCM-MSC formada-se em filme de quitosana. Nenhuma complicação foi observada no estudo em relação a morbidade, estresse crescentes efeitos, ou infecção do tecido. O escore funcional total dos ratos operados em 7 dias foi menor do que ratos normais, mas retornou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia. Golo de histológico da cicatrização tecidual confirmou a presença de um coágulo em defeitos tratados avaliada em 7 dias, ausência de reação de corpo estranho e progredindo cura em 28 dias. Este modelo de defeito do tendão patelar bilateral controla variação inter-individual, através da criação de um controle interno em cada rato, foi associado com morbidade aceitável e permitiu a deteção das diferenças entre os tendões não tratados e tratamentos.

Introduction

Lesão no tendão é uma das causas mais comuns de significativa atrofia muscular e dor em toda a espécie¹. Em medicina veterinária, lesões de tendões e ligamentos são de especial interesse em cavalos, 82% de todas as lesões em cavalos de corrida envolvem o sistema músculo-esquelético, e 46% daqueles afetam os tendões e ligamentos^2,3. Formação de tecido cicatricial afeta as propriedades biomecânicas dos tendões cicatrizadas e explica o prognóstico guardado para retorno ao Atlético uso após lesões dos tendões flexores; re-ferimento ocorre dentro de 2 anos em até 67% de cavalos tratados conservadoramente⁴. Medicina regenerativa fornece novas alternativas para uma condição que desafia os tratamentos tradicionais. Terapia de células-tronco autólogas produziu alguns animadores resultados^5,6 , mas é limitada pela morbidade associada com a coleção de tecido, administração retardada devido ao processamento/reprogramação de células e a influência da Estado de saúde do paciente (tais como a idade) nas propriedades do tronco células^7,8. Estas limitações fornecem uma lógica para a investigação de células-tronco alogênico como uma alternativa de prateleira. Células derivadas de seus anexos fetais são candidatos atraentes porque eles contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma associado com células-tronco embrionárias. Entre seus anexos fetais, matriz de cordão umbilical (UCM), também chamada geleia de Wharton, é abundante e fácil de coletar.

Independentemente da fonte da célula, aumentar stemness é essencial para estabelecer um banco de células para a medicina regenerativa alogênico. Do ponto de vista funcional, stemness pode ser definido como o potencial para diferenciação de auto-renovação e linhagem multi⁹. Provas de stemness se baseia em proliferação e diferenciação ensaios, juntamente com a expressão de genes marcadores Oct4, Sox2 e Nanog⁹. Uma estratégia para melhorar a stemness se baseia na utilização de biomateriais para servir como nulo enchimentos e transportadoras, realçando a proliferação e diferenciação de UCM-MSCs. Essa abordagem elimina preocupações em relação a manipulação de fatores transcricionais para reprogramar células maduras em células pluripotentes induzidas. Entre os biomateriais considerados como portadores de potenciais para as células-tronco, quitosana é atraente por sua biocompatibilidade e degradabilidade¹⁰. Este aminipolissacarídeo natural é formado por alcalina deacetilação da quitina, a segunda mais abundante polissacarídeo natural, principalmente obtida como um subproduto de marisco¹⁰. Temos anteriormente investigados interações entre MSCs e andaimes de quitosana e observou a formação de esferoides^{11,12,13,14,15, 16}. também informamos sobre a superioridade da condrogênese em quitosana matrizes^{12,13,14,15,16,17, 18}. Mais recentemente, dois estudos independentes descreveram formação de esferoides pelo tecido adiposo e tecido de placenta derivada MSCs cultivadas em um filme de quitosana^19,20. Esta formação de esferoides não apenas reforçada stemness, mas também melhorou a retenção das células estaminais após na vivo implantação²⁰.

A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda espécie tem solicitado o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a fisiopatologia de tendinopatias e testar novas terapias tais como injeções de células-tronco. Em cavalos, tendinite induzida por colagenase é um modelo comum para demonstrar a eficácia usando MSCs no tendão reparação²¹. A relevância desta abordagem é limitada, como as injeções causam alterações inflamatórias agudas, Considerando que tendinopatias clínicas geralmente resultam de crônica overstrain^22,23. Além disso, a indução química de doença do tendão induz uma resposta curativa e não replica o processo de cicatrização prejudicado presente em casos clínicos^22,23. Excisão de um segmento do tendão flexor digital superficial tem sido descrito como um modelo cirúrgico da tendinite em cavalos²⁴. Mais recentemente, uma abordagem minimamente invasiva foi usada para restringir o dano traumático para o núcleo central do tendão flexor digital superficial²⁵. Modelos cirúrgicos não simular o mecanismo de fadiga que pode levar à doença natural do tendão e tendem a falta de reprodutibilidade na extensão do dano criado²⁵. Independentemente do modelo, a morbidade e custo associado com equinos modelos do tendão doenças são limitações adicionais, que justificam o interesse em modelos de roedores como um primeiro passo na vivo avaliação de novas terapias.

Uma das principais vantagens de modelos experimentais em roedores consiste o custo e a capacidade de controlar a variabilidade inter-individual. Roedores podem ser padronizados em relação a vários fatores fisiológicos devido a suas taxas de crescimento rápido e relativamente curta expectativa de vida, limitando as fontes de variação e, portanto, reduzindo o número de animais necessários para detectar diferenças. Estratégias para induzir doenças tendão em roedores têm confiado na indução química, mas também na criação cirúrgica de tendão parcial defeitos²¹. Modelos cirúrgicos podem simular melhor do que os modelos químicos naturais tendinopatias, mas podem levar a maior morbidade e falha catastrófica do tendão danificado. A esse respeito, ratos parecem candidatos melhores do que os ratos para estes modelos, como seu tamanho permite a criação de defeitos maiores, facilitando a avaliação da cicatrização tecidual. Foram utilizados ratos Sprague Dawley em estudos experimentais de tendinopatias em quatro grupos principais do tendão: manguito rotador, flexor, Aquiles e tendões patelar²⁶. Entre estes, modelos envolvendo o tendão patelar são especialmente atraentes por causa do tamanho maior deste tendão e a facilidade de acessá-lo²⁷. O tendão patelar anexa o músculo quadríceps a tuberosidade tibial. No âmbito deste mecanismo extensor, a patela é um osso sesamoide que direciona a ação do quadríceps e delineia a extensão proximal do tendão patelar. A presença de âncoras ósseas nas extensões proximais e distais do tendão patelar facilita testes biomecânicos. Modelos envolvendo o tendão patelar normalmente dependem de defeitos cirúrgicos unilaterais, com um tendão intacto contralateral, servindo como um controle^28,29. O modelo mais comum de defeito do tendão patelar envolve a excisão da porção central (1 mm de largura) do tendão patelar partir do ápice distal da patela para a inserção da tuberosidade da tíbia, enquanto o tendão patelar contralateral é deixado intacto. Medidas de resultados incluíram, histologia, testes biomecânicos não-destrutivos ou testes biomecânicos para falha, ultra-sonografia, ex vivo imagens de fluorescência, observação bruta e testes funcionais^{28,30 ,31}. Modelos unilaterais não permitir a comparação de um tratamento proposto com tratamento conservador de lesão semelhante dentro do mesmo animal. Da mesma forma, a comparação entre os vários tratamentos requer animais separados. Um modelo bilateral seria eliminar variações inter individuais e reduzir o número de animais necessários para um estudo de³². No entanto, lesões bilaterais podem aumentar a morbidade e claudicação bilateral poderia comprometer a avaliação do tratamento. Alguns estudos relatam brevemente o uso do tendão patelar bilateral defeitos em ratos mas foco sobre os efeitos dos tratamentos, ao invés de gestão peri-operatório e morbidade do modelo^33,34.

Objetivo a longo prazo do presente estudo é desenvolver uma estratégia para melhorar a sobrevivência de stemness e na vivo da UCM-MSCs destinado a transplante alogênico. Para atingir este objetivo, recentemente informamos stemness melhorada da UCM-MSCs por formação de esferoides em filme de quitosana e incubação sob ambiente hipóxico³⁵. Essas propriedades em vitro foram associadas com melhoria propriedades biomecânicas do tendão patelar defeitos tratados com condicionado UCM-MSCs. com base nestes resultados, o modelo de defeito do tendão patelar bilateral de rato parece apropriado para testar o candidato tratamentos para lesões de tendão³⁶. A finalidade do estudo relatado aqui é fornecer protocolos detalhados para isolamento e caracterização de UCM-MSCs, elaboração de um sistema biológico de células-tronco, criação e tratamento de defeitos de tendão patelar bilateral e pós-operatório recuperação e avaliação de cura dentro dos defeitos de tecido.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de Western University of Health Sciences e institucional Cuidado Animal. 1. isolamento e expansão de MSCs da matriz equina do Cordão Umbilical Obter a placenta de uma égua adulta (grávida), depois observou parto e isolar assepticamente o cordão umbilical da placenta. Mantenha o cordão umbilical em solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante a transfe…

Representative Results

No estudo atual, os resultados são apresentados como média ± DP (desvio padrão). As células foram isoladas a partir do cordão umbilical de 6 mares e porcentagem de linhas de células isoladas expressando cada marcador de superfície celular sob condicionamento standard ou quitosana foram comparados com um teste de Friedman, como uma análise de variância não-paramétrica com repetidas medidas. Para a criação de modelo de defeito do tendão, 8 ratos foram utilizados para avaliaç…

Discussion

Células de equinos foram Selecionadodas para este projeto porque pretendemos eventualmente testar abordagens de candidato na gestão de tendinopatias naturais em cavalos. De fato, lesões dos tendões em cavalos são atraentes como modelos naturais de tendinopatia no homem por causa da similaridade biológica entre os equino flexor digital superficial e tendão de Aquiles em seres humanos⁴¹. Marcadores superfície celular CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II foram selecionados para immunophenotyping …

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable