Оценка терапии стволовой клетки в модели двустороннего коленного сухожилия травмы в крыс

Summary

Этот документ описывает подготовку и оценку сфероидов матрица производные мезенхимальных стволовых клеток пуповины с моделью дефект двусторонних коленного сухожилия в крысу. Эта модель был связан с приемлемым заболеваемости был найден для выявления различий между необработанных и обработанных сухожилий и между двумя процедурами испытания.

Abstract

Регенеративной медицины обеспечивает Роман альтернатив для условий, которые ставят под угрозу традиционные методы лечения. Распространенность и заболеваемость плеча различных видов, в сочетании с ограниченной целебные свойства этой ткани, запрос поиска для клеточной терапии и самоходные разработка экспериментальных моделей для изучения их эффективности. Матрица производные мезенхимальные стволовые клетки пуповинной (UCM-MSC) являются привлекательными кандидатами, потому что они обильные, легко собирать, обойти этические проблемы и риск формирования тератома, но более тесно напоминающие примитивные стволовые клетки чем Взрослый ткани производные MSCs. значительный интерес была сосредоточена на Хитозан как стратегию для повышения свойств MSCs через сфероида формирования. Этот документ детали методы, чтобы изолировать UCM-MSCs, подготовить сфероидов хитозана фильм и анализировать влияние сфероида формирование на поверхности маркер выражения. Следовательно для имплантации в vivo сфероидов UCM-MSC, сформированные на фильм хитозана описано создание модели двустороннего коленного сухожилия травмы в крыс. Без осложнений было отмечено в исследовании в отношении заболеваемости, подчеркнуть рост эффекты, или ткани инфекции. Общая функциональная оценка оперированных крыс на 7 дней был ниже, чем у нормальных крыс, но вернулся к нормальной в течение 28 дней после операции. Гистологические десятки заживления тканей подтвердили наличие сгусток в лечение дефектов оценивается в 7 дней, отсутствие реакции инородного тела и прогрессирует исцеления в 28 дней. Эта модель дефект двусторонних коленная чашечка сухожилие управляет между индивидуальной вариативности через создание внутреннего контроля в каждом крыса, связанные с приемлемым заболеваемости и позволить выявить различия между необработанной сухожилий и лечения.

Introduction

Сухожилия травмы является одним из наиболее распространенных причин значительные боли и мышечные атрофии различных видов¹. В ветеринарной медицины сухожилия и связки травмы представляют особый интерес в лошадей, 82% всех травм в гонке лошади включать опорно-двигательного аппарата, а 46% из них влияет на сухожилий и связок,^2,3. Формирование рубцовой ткани влияет на биомеханические свойства исцелил сухожилий и объясняет охраняемой прогноз для возвращения спортивная(ый) использования после сгибателей сухожилия травм; Re травм происходит в течение 2 лет в до 67% лошадей консервативному⁴. Регенеративной медицины обеспечивает Роман альтернативы условие, что проблемы традиционных методов лечения. Аутологичных стволовых клеток выпустила некоторые обнадеживающие результаты^5,6 , но ограничивается заболеваемости, связанный с ткани коллекции, из-за обработки/перепрограммирование задержки отправления клеток и влияние состояние здоровья пациента (например, возраст) на свойства стволовых клеток,^7,8. Эти ограничения обеспечивают обоснование для расследования аллогенных стволовых клеток в качестве альтернативы готовых. Плода придатков матки производные клетки являются привлекательными кандидатами, потому что они обойти этические проблемы и риск формирования тератома, связанные с эмбриональных стволовых клеток. Среди плода придатков матки пуповины матрица (ЦСМ), также названный Wharton желе, обильные и легко собрать.

Независимо от источника клеток повышения stemness необходимо создать банк клеток аллогенной восстановительной медицины. С функциональной точки зрения stemness можно определить как потенциал для самообновления и несколькими линии дифференциации⁹. Свидетельство о stemness опирается на пролиферации и дифференцировки анализов, а также выражение гена маркеры Oct4, Sox2 и Nanog⁹. Одной из стратегий повышения stemness основывается на использовании биоматериалов в качестве наполнителей и перевозчиков, повышению пролиферации и дифференцировки UCM-MSCs. Этот подход устраняет озабоченность по поводу манипуляции транскрипционный анализ факторов перепрограммировать зрелых клеток в индуцированных плюрипотентных клеток. Среди биоматериалов, рассматривать в качестве потенциальных носителей для стволовых клеток chitosan является привлекательным для его биосовместимость и разлагаемость¹⁰. Этот естественный аминополисахарид формируется щелочное дезацетилирование хитина, вторым наиболее распространенным природный полисахарид, главным образом получены как subproduct моллюсков¹⁰. Мы уже исследованы взаимодействия между MSCs и хитозана леса и наблюдали образование сфероидов^{11,12,13,14,15, 16}. Мы также сообщали о превосходстве chondrogenesis хитозана матриц^{12,13,14,,1516,17, 18}. Совсем недавно два независимых исследований описано формирование сфероидов жировой ткани и ткани плаценты производных MSCs, культивируемых в фильме хитозана^19,20. Это образование сфероидов не только расширение stemness, но также улучшено сохранение стволовых клеток после в vivo имплантации²⁰.

Распространенность и заболеваемость плеча различных видов побудили разработка экспериментальных моделей для изучения патофизиологии Тендинопатии и тестирования новых методов лечения, таких как инъекции стволовых клеток. В лошадей коллагеназа индуцированной тендинит — это общая модель для демонстрации эффективности с помощью MSCs в сухожилие ремонт²¹. Актуальность этого подхода ограничена, как инъекции вызывают острые воспалительные изменения, тогда как клинический Тендинопатии обычно являются результатом хронического перенапряжения^22,23. Кроме того химической индукции сухожилия болезнь вызывает исцеления ответ и не реплицирует нарушение заживления в клинических случаев^22,23. Иссечение сегмента сухожилие поверхностного цифровой сгибатели был описан как хирургические модель тендинит в лошадей²⁴. Совсем недавно миниинвазивная подход был использован для ограничения травматических повреждений центральное ядро поверхностные цифровой сгибателей сухожилия²⁵. Хирургическое модели не имитировать усталость механизм, который может привести к естественной сухожилия болезни и, как правило, не хватает воспроизводимость в степени повреждения, создал²⁵. Независимо от модели, заболеваемости и затраты, связанные с лошадей модели сухожилия заболевания являются дополнительные ограничения, которые оправдывают интерес к грызунов модели в качестве первого шага в естественных условиях оценки Роман терапии.

Одно из главных достоинств экспериментальных моделей на грызунах состоит из стоимости и способность контролировать межличностная изменчивость. Грызунов может быть стандартизирована в отношении различных физиологических факторов из-за их быстрые темпы роста и относительно короткой продолжительности жизни, ограничение источников вариации и тем самым уменьшая количество животных, необходимых для выявления различий. Стратегии чтобы побудить сухожилия болезни грызунов полагались на химической индукции, но и на хирургическое создание частичных сухожилия дефекты²¹. Хирургическое модели могут имитировать природные Тендинопатии лучше, чем химические модели, но может привести к более высокой заболеваемости и авария поврежденные сухожилия. В этом отношении крысы, кажется лучше кандидатов, чем мышей для этих моделей, как их размер позволяет создание более крупных дефектов, способствуя тем самым оценки заживления тканей. Крысах Sprague-Dawley были использованы в экспериментальных исследованиях Тендинопатии в четырех основных сухожилий групп: манжета ротатора, сгибателей, Ахиллес и²⁶коленного сухожилия. Среди них модели с участием коленного сухожилия являются особенно привлекательными из-за большего размера этой сухожилия и легкость доступа к нему,²⁷. Коленного сухожилия четырехглавой мышцы придает бугристости большеберцовой кости. В рамках этой разгибателей механизм надколенника является Сесамовидные кости, которая направляет действия четырехглавой и очерчивает проксимальных степени коленного сухожилия. Присутствие костлявые якорей в проксимальном и дистальном экстентов коленного сухожилия облегчает биомеханические тесты. Модели с участием коленного сухожилия обычно полагаются на односторонний хирургический дефектов, с контралатеральной сухожилие нетронутыми служит управления^28,29. Наиболее распространенная модель дефект коленного сухожилия включает в себя вырезание Центральная часть (1 мм в ширину) коленного сухожилия от дистальной верхушки надколенника для вставки бугристости большеберцовой кости, в то время как контралатеральной коленного сухожилия остается без изменений. Меры исходы включали гистологии, биомеханические Неразрушающий или биомеханические тестирования сбоя, УЗИ, ex vivo флуоресценции изображений, брутто наблюдения и функциональные тесты^{28,30 ,31}. Одностороннее модели не позволяют сравнения предлагаемого лечения с консервативное управление подобные травмы в то же самое животное. Аналогичным образом сравнение между несколькими лечения требует отдельных животных. Двусторонние модель будет устранить различия между отдельными и уменьшить количество животных, необходимых для исследования³². Однако двусторонние травмы может привести к увеличению заболеваемости, и двусторонние хромота может препятствовать оценки лечения. Несколько исследований кратко сообщают об использовании двусторонних коленного сухожилия дефектов в крыс, но внимание на последствия лечения, вместо того, чтобы Управление периоперационную и заболеваемости модели^33,34.

Долгосрочная цель этого исследования заключается в разработке стратегии для улучшения stemness и в естественных условиях выживание UCM-MSCs суждено аллогенной трансплантации. Для достижения этой цели, мы недавно сообщили более stemness путем формирования сфероидов UCM-МСК на фильм хитозана и инкубации при гипоксических окружающей среды³⁵. Эти свойства в vitro были связаны с улучшенными биомеханическими свойствами коленного сухожилия дефектов, относились с кондиционером UCM-MSCs. на основе этих результатов, крыса двусторонних коленного сухожилия дефект модель кажется подходящим для проверки кандидата лечение травм сухожилия³⁶. Цель исследования сообщили здесь заключается в предоставлении подробных протоколов для изоляции и характеристика UCM-MSCs, подготовка биологические системы доставки для создания, стволовые клетки и лечение двусторонних коленная чашечка сухожилие дефектов и послеоперационные восстановление и оценки исцеление в пределах дефекты ткани.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Западного университета медицинских наук. 1. изоляция и расширение MSCs от лошадиного пуповины матрица Получить через плаценту от взрослых кобылы (беременности) пос…

Representative Results

В текущем исследовании результаты представлены как означает ± SD (стандартное отклонение). Клетки были изолированы от пуповины 6 кобыл, и процент изолированных клеточных линий, выражая поверхности маркер каждой ячейки под стандарт или Хитозан принадлежности были сопо?…

Discussion

Лошадиный клетки были отобраны для этого проекта потому, что мы в конечном итоге намерены проверить кандидат подходы в управлении природных Тендинопатии лошадей. Сухожилия травм в лошадей действительно привлекательным, как природные модели плеча в человеке за биологическое сходство …

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable