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Articolo metodologico

Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

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DOI:

10.3791/56812

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3 gennaio 2018

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In questo articolo

Sommario

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

Abstract

Bicelles sono assembly sintonizzabile discoidale polimolecolari formato da una grande varietà di miscele del lipido. Le applicazioni spaziano da studi strutturali di proteine di membrana di risonanza magnetica nucleare (NMR) agli sviluppi nanotecnologici, compresa la formazione di gel otticamente attivi e magneticamente commutabile. Tali tecnologie richiedono elevato controllo delle dimensioni di montaggio, risposta magnetica e resistenza termica. Miscele di 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC) e suoi ioni lantanidi (Ln3 +) chelanti coniugato del fosfolipide, 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenico triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), assemblare in assembly altamente magneticamente reattivo ad esempio DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (rapporto molare 4:1:1) bicelles. Introduzione di colesterolo (Chol-OH) e steroidi derivati in doppio strato si traduce in un altro insieme di assembly che offre proprietà fisico-chimiche uniche. Per una composizione lipidica dato, il alignability magnetico è proporzionale alla dimensione di bicelle. La complessazione di Ln3 + si traduce in risposte magnetiche senza precedenti in termini di direzione sia di grandezza e di allineamento. Il crollo di termo-reversibile del disco-come le strutture in vescicole su riscaldamento permette di sartoria di dimensioni degli assiemi per estrusione attraverso filtri a membrana con pori definiti. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate mediante raffreddamento a 5 ° C, con conseguente montaggio dimensioni definite da precursori della vescicola. Qui, questa procedura di montaggio è spiegata e la alignability magnetica delle assemblee è quantificata mediante misure di birifrangenza sotto un 5,5 campo magnetico T. Il segnale di birifrangenza, proveniente dal bilayer del fosfolipide, ulteriormente consente il monitoraggio di polimolecolari cambiamenti che si verificano in doppio strato. Questa semplice tecnica è complementare agli esperimenti NMR che sono comunemente impiegati per caratterizzare bicelles.

Introduzione

Bicelles sono assembly polimolecolari discoidale ottenuti dalle numerose miscele di lipidi. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 essi sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di biomolecole di membrana tramite spettroscopia NMR. 6 , 7 tuttavia, i recenti sforzi mirano a espandere il campo delle possibili applicazioni. 5 , 8 , 9 il sistema di bicelle più....

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Protocollo

1. procedura di fabbricazione DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly

  1. Preparazioni preliminari
    1. Lavare tutta la vetreria di vampate di calore una volta con etanolo stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e asciugare con aria compressa.
    2. Produrre 2 soluzioni di riserva distinti 10 mg/mL di DMPC e DMPE-DTPA in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio), una soluzione stock di 10 mM di Chol-OH in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e una soluzione stock di 10 mM di TmCl3 in metanolo.
    3. ....

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Risultati

Il segnale di birifrangenza di una non-estruso DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) campione è stato monitorato sotto un 5,5 campo magnetico T durante un riscaldamento e raffreddamento da 5 a 40 ° C e ritorno a un tasso di 1 ° C/min (Figura 6). I risultati di birifrangenza confermano alti allineamenti magnetici a 5 ° C con un valore di 1.5 x 10-5, due volte più forte per quanto riguarda i sistemi di estrusi segnalati.

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Discussione

Un resoconto dettagliato di come birifrangenza misure sono state usate in combinazione con SANS esperimenti per valutare i metodi per la generazione altamente magneticamente reattivo Ln3 + chelanti fosfolipidi assembly è in Isabettini et al. 23 i protocolli di fabbricazione proposto sono anche applicabili per gli assembly composti dei fosfolipidi DPPC e DPPE-DTPA più lunghi o per quelli contenenti derivati steroidi chimicamente derivati dal loro doppio strato.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono la Swiss National Science Foundation per finanziamento SMhardBi (progetto numero 200021_150088/1). I SANS esperimenti sono stati eseguiti presso la sorgente di neutroni di spallazione svizzero SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Svizzera. Gli autori ringraziano calorosamente il Dr. Joachim Kohlbrecher per la sua guida con gli esperimenti SANS. Il setup di misura birifrangenza sotto alti campi magnetici è stato ispirato dal programma di installazione esistente presso il laboratorio di magnetico ad alto campo HFML, Nijmegen, Paesi Bassi. Ringraziamo Bruno Pfister per il suo aiuto nello sviluppo dell'elettronica del setup birifrangenza, Jan Cors....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)Avanti Polar Lipids850345P>99%
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolammina-dietilene triamminapentaacetato sale acido di esammonio (DMPE-DTPA)Avanti Polar Lipids790535P>99%
Cloruro di tulio (III)Sigma-Aldrich439649anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce di base
Disprosio(III) CloruroSigma-Aldrich325546anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce di
base Itterbio (III) Cloruro di itterbio(III)Sigma-Aldrich439614anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce
CloroformioSigma-Aldrich319988contiene etanolo come stabilizzante, reagente ACS, ≥ 99,8%
MetanoloSigma-Aldrich34860≥ 99,9%
ColesteroloAmresco433Grado ultra puro
D2OSostanze chimiche ARMAR141099,8 atom % D Acqua
ultrapuraMilliporeSynergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
misuratore elettronico di pHMetrohm17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtro a membranaVWR515-2028
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 200nmVWR515-2029
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 400nmVWR515-2030
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 800nmVWR515-2032
Whatmann Carta da filtroVWR230600
Pallone a fondo tondo da 25 mlVWR201-135214/23 NS
3 ml di vetro snap-cupVWR548-0554ND18, 18x30mm
Siringa di vetro da 2,5 mlHamilton
Sodio diidrogeno fosfato diidratoMerk1.06342Sale usato per fare il tampone fosfato
di-Sodio idrogeno fosfatoMerk1.06586Sale usato per fare il tampone fosfato
Azoto liquidoCarbaga-
Azoto gassoso pressurizzatoBottiglia Carbagas-200bar
Estrusore lipidico 10 mlLipex-Completamenteequipaggiato con thermobarrel
Tubo in PVC ad alta pressioneGR NETUM-deveresistere a più di 4 MPa
Adattatori SertoSertot-Nitrile
VWR-2
ml pipette di vetroVWR612-1702230 mm di lunghezza
Diodo LaserNewportLPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in AmplifierSRSSR830
Rivelatore di fotodiodiSilonex Inc.SLSD-71N55mm2, silicio, fotoconduttivo
5.5 T criogenico magneticocriogenico/Oerlikon AG-12bar He-raffreddato. Compressore RW4000/6000, testa criogenica RGD 5/100 TA
Filtro passa-basso di secondo ordineAlimentatore lineare integrato in casa24V DC, secondo ordine, Chiave Sallen, frequenza di taglio 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Modulatore fotoelasticoHinds instrumentsPEM-90
Glan-Thompson Polarizzatore di calciteNewport10GT04diametro 25,4 mm
HellmaCella a temperatura controllata 165-10-40, 0,8 ml, lunghezza percorso 10 mm
Sonda di temperaturaThermocontrol-TypeK, diametro 0,5 mm, Thermocoax
Specchi non polarizzantiNewport50326-1002Cavi RS 232 da 25,4 mm
National Instruments189284-02Per il collegamento alla porta RS-232 sulla parte anteriore dei controller Compact FieldPoint
BNC 50 e Omega; Cavi e connettoriNational Instruments763389-01
cFP-AI-110National Instruments777318-110Modulo di ingresso analogico di tensione e corrente a 8 canali per Compact FieldPoint
cFP-CB-1National Instruments778618-01Blocco connettore integrato per il cablaggio a Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3National Instruments778618-03Blocco connettore isotermico integrato per il cablaggio di termocoppie al modulo cFP-TC-120
cFP-TC-120National Instruments777318-120di input per termocoppia a 8 canali per Compact FieldPoint
cFP-1804National Instruments779490-01Interfaccia Ethernet/seriale per NI Compact FieldPoint
LabView 2010NationalInstruments-Industrial
Power TracoPowerTCL 060-124100-240V AC
BagnomariaJulaboFP40-HECircolatore refrigerato/Riscaldamento
Guanti Cuvetta campione di quarzo Modulo

Riferimenti

  1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
  2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane....

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Ristampe e permessi

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