Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Summary

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

Abstract

Bicelles sono assembly sintonizzabile discoidale polimolecolari formato da una grande varietà di miscele del lipido. Le applicazioni spaziano da studi strutturali di proteine di membrana di risonanza magnetica nucleare (NMR) agli sviluppi nanotecnologici, compresa la formazione di gel otticamente attivi e magneticamente commutabile. Tali tecnologie richiedono elevato controllo delle dimensioni di montaggio, risposta magnetica e resistenza termica. Miscele di 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC) e suoi ioni lantanidi (Ln^{3 +}) chelanti coniugato del fosfolipide, 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenico triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), assemblare in assembly altamente magneticamente reattivo ad esempio DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) bicelles. Introduzione di colesterolo (Chol-OH) e steroidi derivati in doppio strato si traduce in un altro insieme di assembly che offre proprietà fisico-chimiche uniche. Per una composizione lipidica dato, il alignability magnetico è proporzionale alla dimensione di bicelle. La complessazione di Ln^{3 +} si traduce in risposte magnetiche senza precedenti in termini di direzione sia di grandezza e di allineamento. Il crollo di termo-reversibile del disco-come le strutture in vescicole su riscaldamento permette di sartoria di dimensioni degli assiemi per estrusione attraverso filtri a membrana con pori definiti. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate mediante raffreddamento a 5 ° C, con conseguente montaggio dimensioni definite da precursori della vescicola. Qui, questa procedura di montaggio è spiegata e la alignability magnetica delle assemblee è quantificata mediante misure di birifrangenza sotto un 5,5 campo magnetico T. Il segnale di birifrangenza, proveniente dal bilayer del fosfolipide, ulteriormente consente il monitoraggio di polimolecolari cambiamenti che si verificano in doppio strato. Questa semplice tecnica è complementare agli esperimenti NMR che sono comunemente impiegati per caratterizzare bicelles.

Introduction

Bicelles sono assembly polimolecolari discoidale ottenuti dalle numerose miscele di lipidi. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} essi sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di biomolecole di membrana tramite spettroscopia NMR. ^{6 , 7} tuttavia, i recenti sforzi mirano a espandere il campo delle possibili applicazioni. ^{5 , 8 , 9} il sistema di bicelle più....

Protocol

1. procedura di fabbricazione DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly

1. Preparazioni preliminari
   1. Lavare tutta la vetreria di vampate di calore una volta con etanolo stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e asciugare con aria compressa.
   2. Produrre 2 soluzioni di riserva distinti 10 mg/mL di DMPC e DMPE-DTPA in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio), una soluzione stock di 10 mM di Chol-OH in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e una soluzione stock di 10 mM di TmCl₃ in metanolo.
   ....

Results

Il segnale di birifrangenza di una non-estruso DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) campione è stato monitorato sotto un 5,5 campo magnetico T durante un riscaldamento e raffreddamento da 5 a 40 ° C e ritorno a un tasso di 1 ° C/min (Figura 6). I risultati di birifrangenza confermano alti allineamenti magnetici a 5 ° C con un valore di 1.5 x 10^-5, due volte più forte per quanto riguarda i sistemi di estrusi segnalati.

Discussion

Un resoconto dettagliato di come birifrangenza misure sono state usate in combinazione con SANS esperimenti per valutare i metodi per la generazione altamente magneticamente reattivo Ln^{3 +} chelanti fosfolipidi assembly è in Isabettini et al. ²³ i protocolli di fabbricazione proposto sono anche applicabili per gli assembly composti dei fosfolipidi DPPC e DPPE-DTPA più lunghi o per quelli contenenti derivati steroidi chimicamente derivati dal loro doppio strato.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolammina-dietilene triamminapentaacetato sale acido di esammonio (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Cloruro di tulio (III)	Sigma-Aldrich	439649	anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce di base
Disprosio(III) Cloruro	Sigma-Aldrich	325546	anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce di
base Itterbio (III) Cloruro di itterbio(III)	Sigma-Aldrich	439614	anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce
Cloroformio	Sigma-Aldrich	319988	contiene etanolo come stabilizzante, reagente ACS, ≥ 99,8%
Metanolo	Sigma-Aldrich	34860	≥ 99,9%
Colesterolo	Amresco	433	Grado ultra puro
D2O	Sostanze chimiche ARMAR	1410	99,8 atom % D Acqua
ultrapura	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
misuratore elettronico di pH	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtro a membrana	VWR	515-2028
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm	VWR	515-2029
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm	VWR	515-2030
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm	VWR	515-2032
Whatmann Carta da filtro	VWR	230600
Pallone a fondo tondo da 25 ml	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml di vetro snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
Siringa di vetro da 2,5 ml	Hamilton
Sodio diidrogeno fosfato diidrato	Merk	1.06342	Sale usato per fare il tampone fosfato
di-Sodio idrogeno fosfato	Merk	1.06586	Sale usato per fare il tampone fosfato
Azoto liquido	Carbaga-
Azoto gassoso pressurizzato	Bottiglia Carbagas-200		bar
Estrusore lipidico 10 ml	Lipex-Completamente		equipaggiato con thermobarrel
Tubo in PVC ad alta pressione	GR NETUM-deve		resistere a più di 4 MPa
Adattatori Serto	Sertot-Nitrile
	VWR-2
ml pipette di vetro	VWR	612-1702	230 mm di lunghezza
Diodo Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Rivelatore di fotodiodi	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, silicio, fotoconduttivo
5.5 T criogenico magnetico	criogenico/Oerlikon AG-12		bar He-raffreddato. Compressore RW4000/6000, testa criogenica RGD 5/100 TA
Filtro passa-basso di secondo ordine	Alimentatore lineare integrato in casa		24V DC, secondo ordine, Chiave Sallen, frequenza di taglio 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Modulatore fotoelastico	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Polarizzatore di calcite	Newport	10GT04	diametro 25,4 mm
	Hellma	Cella a temperatura controllata 165-10-40	, 0,8 ml, lunghezza percorso 10 mm
Sonda di temperatura	Thermocontrol-Type		K, diametro 0,5 mm, Thermocoax
Specchi non polarizzanti	Newport	50326-1002	Cavi RS 232 da 25,4 mm
	National Instruments	189284-02	Per il collegamento alla porta RS-232 sulla parte anteriore dei controller Compact FieldPoint
BNC 50 e Omega; Cavi e connettori	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	Modulo di ingresso analogico di tensione e corrente a 8 canali per Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Blocco connettore integrato per il cablaggio a Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Blocco connettore isotermico integrato per il cablaggio di termocoppie al modulo cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	di input per termocoppia a 8 canali per Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Interfaccia Ethernet/seriale per NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National	Instruments-Industrial
Power Traco	Power	TCL 060-124	100-240V AC
Bagnomaria	Julabo	FP40-HE	Circolatore refrigerato/Riscaldamento