Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico
Summary
Se presenta un protocolo para la selección en vitro y caracterización del ácido ftálico de grupo específico éster enlace DNA aptámeros. También se incluye la aplicación de los aptámeros seleccionados en un aptasensor electroquímico.
Abstract
Ácido ftálico ésteres (PAEs) sonuno de los principales grupos de contaminantes orgánicos persistentes. La detección específica de grupo de PAEs se desea altamente debido al crecimiento rápido de sus congéneres. ADN los aptámeros se han aplicado cada vez más como elementos de reconocimiento en las plataformas de biosensor, pero selección de aptámeros hacia objetivos altamente hidrofóbico molécula pequeña, como PAEs, se divulgan raramente. Este trabajo describe un método basado en el grano diseñado para seleccionar grupo específico DNA aptámeros a PAEs. El grupo amino funcionalizados ftalato de dibutilo (DBP-NH2) como el destino de anclaje fue sintetizado e inmovilizado en las perlas de agarosa epoxy-activado, que permite la visualización del grupo éster ftálico en la superficie de la matriz de inmovilización, y por lo tanto la selección de las carpetas de grupo específica. Determinamos las constantes de disociación de los candidatos de aptámeros por reacción en cadena de polimerización cuantitativa juntada con separación magnética. La relativa afinidad y selectividad de los aptámeros para otros PAEs se determinaron por el análisis competitivos, donde los candidatos de aptámeros fueron previamente delimitados al DBP-NH2 une bolas magnéticas y lanzado en el sobrenadante tras la incubación con las prueba PAEs u otras sustancias interferentes potenciales. El análisis competitivo se aplicó porque proporcionó una comparación fácil afinidad entre PAEs que sin grupos funcionales para la inmovilización de superficie. Finalmente, demostró la fabricación de un aptasensor electroquímica y había utilizado para la detección ultrasensible y selectiva de ftalato de bis(2-ethylhexyl). Este protocolo proporciona información detallada para el descubrimiento de los aptámeros de otras pequeñas moléculas hidrofóbicas.
Introduction
Junto con el rápido desarrollo económico, aceleración de la industrialización y la construcción urbana, la contaminación ambiental es más grave que nunca. Contaminantes ambientales típicos incluyen iones de metales pesados, toxinas, antibióticos, pesticidas, disruptores endocrinos y contaminantes orgánicos persistentes (COP). Además de los iones del metal y las toxinas, otros contaminantes son moléculas pequeñas que muy a menudo consisten en una variedad de congéneres. Por ejemplo, los contaminantes orgánicos persistentes más tóxicos son los bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), éteres de bifenilo polibromado (PBDE), policlorados dibenzo-p-dioxinas (PCDD), dibenzofuran policlorados (PCDF) y ftálico ésteres del ácido (PAEs)1,2, que consisten en muchos congéneres. Pequeña molécula de detección se ha realizado principalmente por las técnicas basadas en espectrometría de cromatografía/masa debido a su diversidad de aplicaciones3,4,5,6. Para la detección in situ, métodos basados en anticuerpos han sido recientemente desarrollados7,8,9. Sin embargo, puesto que estos métodos son altamente específicos para un determinado producto de la familia, deben realizarse múltiples pruebas. Lo más grave es que los congéneres novela crecen tan rápido que sus anticuerpos se pueden generar en el tiempo. Por lo tanto, el desarrollo de biosensores específicos de grupo para monitorear los niveles totales de todos sus congéneres en una prueba puede proporcionar una métrica valiosa para evaluar el estado de contaminación del medio ambiente.
Recientemente, el ácido nucleico aptámeros se ha aplicado extensamente como elementos de reconocimiento en diversas plataformas de biodetección debido a su capacidad de reconocer una gran variedad de objetivos, de los iones y moléculas pequeñas de proteínas y células de10,11 ,12. Los aptámeros son identificados a través de un método en vitro llamado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX)13,14. SELEX comienza con la biblioteca de oligonucleótidos al azar hebra sintética, que contiene aproximadamente 1014-1015 secuencias. El tamaño de la biblioteca al azar asegura la diversidad de las estructuras de ARN o ADN candidato. El proceso SELEX típico consiste en múltiples rondas de enriquecimiento hasta que la biblioteca se ha enriquecido en las secuencias con alta afinidad y especificidad a la meta. La piscina enriquecida final entonces se ordena, y las constantes de disociación (Kd) y selectividad contra potencial sustancias interferentes son determinadas por diferentes técnicas como filtro vinculante, cromatografía de afinidad, superficie resonancia de Plasmon (SPR), etcetera. 15
Debido a la solubilidad de agua muy pobre y falta de grupos funcionales para la inmovilización de superficie, la selección de aptámeros de POPs es teóricamente difícil. Avances significativos para SELEX han acelerado el descubrimiento de los aptámeros. Sin embargo, la selección de aptámeros grupo-específica para POPs no todavía se ha divulgado. Hasta ahora, sólo PCB vinculante ADN aptámeros con alta especificidad para un determinado producto de la familia han sido identificados16. PAEs se utilizan principalmente en materiales de cloruro de polivinilo, cambio un plástico elástico, actuando así como un plastificante cloruro de polivinilo de un plástico duro. Algunos PAEs han sido identificadas como disruptores endocrinos, puede causar graves daños al hígado y función renal, reducir la motilidad de los espermatozoides masculinos y puede resultar en la morfología espermática anormal y cáncer testicular17. El compuesto – ni específico de grupo enlace PAE aptámeros se han divulgado.
El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo representativo de selección de aptámeros de ADN específico de grupo altamente hidrofóbico moléculas pequeñas como PAEs, un grupo representativo de POPs. También demostramos la aplicación de los aptámeros seleccionados para la detección de contaminación ambiental. Este protocolo proporciona orientación y perspectivas para el descubrimiento de los aptámeros de otras pequeñas moléculas hidrofóbicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un beneficio excepcional de aptámeros es que se identifican a través del método en vitro SELEX, mientras que los anticuerpos son generados por immunoreactions en vivo . Por lo tanto, los aptámeros seleccionables con especificidad deseado bajo condiciones experimentales bien diseñadas, mientras que los anticuerpos se limitan a las condiciones fisiológicas.
Para facilitar la separación de secuencias límite de secuencias libres, SELEX modificado varios se han divulgado r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (21675112), proyecto clave del plan de ciencia y tecnología de la Comisión de Educación de Beijing (KZ201710028027) y Yanjing joven becario programa de Capital Normal University.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
Riferimenti
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