Vis sperma beoordeling softwarematig en koelingsapparaten
Summary
Dit protocol beschrijft een procedure van vis sperma evaluatie met behulp van computer-assisted sperma-analyse en koelingsapparaten. De software geeft een snelle, nauwkeurige en kwantitatieve analyse van vis spermakwaliteit gebaseerd op de beweeglijkheid van de spermacellen, die kan hierbij een nuttig instrument in de aquacultuur te verbeteren reproductie succes.
Abstract
Voor de evaluatie van de kwaliteit van de gameet zijn er innovatieve, snelle en kwantitatieve technieken die bruikbare gegevens op voor de aquacultuur levert kunnen. Geïnformatiseerde systemen voor sperma analyse werden ontwikkeld voor het meten van verschillende parameters en een van de meest gemeten is de beweeglijkheid van de zaadcellen.
In eerste instantie is deze computertechnologie ontworpen voor soorten zoogdieren, maar kan ook worden gebruikt voor fish sperma analyse. Vissen hebben specifieke kenmerken die sperma beoordeling zoals een korte motiliteit tijd na activering en, in sommige gevallen, aanpassing beïnvloeden kunnen aan lagere temperaturen. Dus, is het noodzakelijk zowel software als hardware onderdelen motiliteit analyse om efficiënter te maken voor fish sperma analyse te wijzigen. Voor zoogdieren sperma, wordt de verwarmingsplaat gebruikt voor het handhaven van optimale temperaturen voor spermacellen. Het is echter voor sommige vissoorten, voordelige met een lagere temperatuur te verlengen van de duur van de motiliteit, aangezien het sperma actief gedurende minder dan 2 minuten blijft. Dus, koeling apparaten zijn nodig om de monsters op constante temperatuur te koelen na verloop van de tijd van analyse, met inbegrip van de optische Microscoop. Dit protocol beschrijft de analyse van de beweeglijkheid van de zaadcellen van de vis met behulp van software voor sperma-analyse en nieuw koelingsapparaten voor het optimaliseren van de resultaten.
Introduction
De werkzaamheid van reproductie, hangt af van de kwaliteit van beide gameten (eieren en sperma)1,2. Dit is de belangrijkste factor die aan een succesvolle bevruchting bijdraagt, waardoor de ontwikkeling van levensvatbare nakomelingen3,4. De gunstige evaluatie van gameet kwaliteit is het beste instrument voor het definiëren van het potentieel van de vruchtbaarheid voor een specimen.
Mengen van sperma van meerdere mannetjes is een gangbare praktijk in de productie van veel commerciële waterdieren4. Echter de sperma variabiliteit tussen mannetjes kan leiden tot sperma competitie en, bijgevolg, niet alle mannen zijn even bij te dragen tot de genenpoel5. In die zin is is de correcte evaluatie van de individuele ejaculaat/spermacellen functies, zoals de motiliteit, fundamenteel voor het verkrijgen van discriminerende informatie over individuele mannelijke vruchtbaarheid potentieel. Directe observatie van de beweeglijkheid van de zaadcellen kan onjuist en subjectieve gegevens opleveren, aangezien het vereist tijd en ervaring, die tot een gebrek aan consistentie en onverenigbaarheid van resultaten6,7 leidt. Er zijn echter vele innovatieve, snelle en kwantitatieve technieken die voor een betrouwbare sperma kwaliteit analyse2,4 zorgen kunnen.
Computer-assisted sperma analyse werd ontwikkeld om bieden nauwkeurige gegevens over sperma kwaliteit8. Deze technologie omvat de ontwikkeling van software die is gekoppeld aan een fasecontrastmicroscoop waarmee de beoordelingvan de beweeglijkheid van de zaadcellen. Een beperkende factor van beweeglijkheid parameter is echter de framesnelheid van de videocamera. Individuele spermacellen trajecten zijn gebaseerd op spermatozoa hoofd centroid positie in opeenvolgende frames van de video-opnamen, zijn, die is gecorreleerd met de flagellar verkeer patronen3,9,10, 11. de belangrijkste kinetische parameters gemeten zijn de lineaire snelheid (VSL), kromlijnige snelheid (VCL) en gemiddelde pad snelheid (VAP). VSL is de afstand tussen de begin- en eindpunt door de spermacellen gedeeld door tijd genomen. VCL is de echte snelheid langs de precieze traject genomen door de spermacellen. VAP is de snelheid langs een afgeleide afgevlakte pad van traject. Deze parameters kunnen extra kinetische informatie, met inbegrip van de afstraffing metingen zoals amplitude van laterale hoofd verkeer (ALH) en beat-cross frequentie (BCF)4,10, lineariteit (LIN), rechtheid (STR) en wiebelen (WOB).
Het sperma analysesysteem werd oorspronkelijk gebruikt voor soorten zoogdieren, en een van de vereisten voor het systeem is om te werken op de lichaamstemperatuur van de donor (ongeveer 37 ° C). Deze software kan ook worden gebruikt voor vissoorten; Hoewel, het is noodzakelijk om enkele aanpassingen om de fout van de resultaten van de analyse van de zaadcellen. In sommige vissoorten, zoals zalmachtigen en paling8,12, optreedt bevruchting bij lage temperatuur (rond 4 ° C)2,4. Dus, koelingsapparaten moet worden ontwikkeld om te voorkomen dat ongemakkelijk arbeidsomstandigheden. Daarnaast vis spermacellen zijn immotile in zaadvocht vloeistof en vereisen een osmotische schok te activeren beweeglijkheid. Voor de zoetwater soorten moeten het medium activator hypotone osmolaliteit, terwijl voor mariene soorten het medium hypertonic moet. Echter voor sommige soorten zou zoals zalmachtigen, de ion-concentratie ook belangrijk3,4,9. Na activering, wordt vis sperma gekenmerkt door een snelle daling van de motiliteit (minder dan 2 min)13,14 en hoge snelheid, wordt van vitaal belang voor het bepalen van de optimale framesnelheid te verkrijgen van betrouwbare gegevens15.
De doelstellingen van deze studie zijn ontwerpen en toepassen van koelsystemen voor vis spermastaaltje. Bovendien, definieert dit protocol hoe om te bepalen van de optimale framesnelheid voor de oprichting van standaardprotocollen afhankelijk van de soort. Het gebruik van dit protocol opent nieuwe deuren in het kader van vis rudimentaire evaluatie, met behulp van de Europese aal als een model.
Protocol
Representative Results
Discussion
De sperma-analysesoftware die wordt gebruikt in dit protocol is gebruikt door onderzoekers wereldwijd voor verschillende soorten, met inbegrip van vis. Vissen hebben echter enkele specifieke functies die invloed kunnen zijn op de beoordeling van de zaadcellen. Vis spermacellen toonde hoge snelheid in het moment van activering die snel daalt en leidt tot een korte tijd van beweeglijkheid na activering. Bovendien, de temperatuur van reproductie is afhankelijk van de soorten en, in sommige gevallen kan ongeveer 4 ° C<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project heeft financiering ontvangen van de associatie van de kosten (voedsel en landbouw kosten actie FA1205: AQUAGAMETE, en de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder de Marie Sklodowska-Curie project IMPRESS (GA No 642893). We zouden graag bedanken het wetenschappelijke team van PROiSER, specifiek voor de student Alberto Vendrell Bernabéu, voor zijn actieve deelname in de video-opname van dit project.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout – the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?. Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O’Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations’ structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
