Fisk spermier bedömning använder programvara och kylanordningar

Summary

Protokolls beskriver förfarandet fisk spermier bedömning med hjälp av datorstödda spermier analys och kylanordningar. Programvaran ger en snabb, korrekt och kvantitativ analys av fisk spermiernas kvalitet baserat på spermier motilitet, vilket kan vara ett användbart verktyg i vattenbruk att förbättra reproduktionen framgång.

Abstract

För gamet kvalitetsbedömning finns det innovativa, snabb och kvantitativa tekniker som kan ge användbara data för vattenbruk. Datoriserade system för spermier analys utvecklades för att mäta flera parametrar och en av de vanligaste uppmätta är spermierörlighet.

Inledningsvis utformades denna datorteknik för däggdjursarter, men det kan även användas för fisk spermier analys. Fisk har särdrag som kan påverka spermier bedömning såsom en kort motilitet tid efter aktivering och, i vissa fall anpassning till lägre temperaturer. Det är således nödvändigt att ändra både mjukvara och hårdvara komponenter för att effektivisera motilitet analys för fisk spermier analys. Spermiereceptorn, används värmeplattan för att upprätthålla optimala temperaturer av spermier. Dock för vissa fiskarter är det fördelaktigt att använda en lägre temperatur för att förlänga varaktigheten av motilitet, eftersom spermierna förbli aktiva i mindre än 2 min. Det är därför nödvändigt att kyla prover vid konstant temperatur över tiden av analys, inklusive på det optiska mikroskopet kylning enheter. Det här protokollet beskriver analys av fisk spermierörlighet använder programvara för spermier analys och nya kylanordningar för att optimera resultaten.

Introduction

Effekten av reproduktion beror på kvaliteten på både könsceller (ägg och spermier)^1,2. Detta är den viktigaste faktorn som bidrar till framgångsrik befruktning, möjliggör utveckling av livskraftiga avkommor^3,4. Den praktiska utvärderingen av könsceller kvalitet är det bästa verktyget för att definiera fertilitet potentialen i ett exemplar.

Blanda sperma från flera hanar är vanligt i produktionen av många vattenlevande kommersiella arter⁴. Men spermier variabiliteten mellan hanar kan leda till spermier konkurrens och följaktligen inte alla män lika bidrar till genbank⁵. I denna mening är korrekt utvärdering av enskilda ejakulat/spermier funktioner, till exempel motilitet, grundläggande för erhålla diskriminerande information angående enskilda manlig fertilitet potentiella. Direkt observation av spermiernas rörlighet kan producera missvisande och subjektiva data eftersom det kräver tid och erfarenhet, vilket leder till bristande konsekvens och inkompatibilitet av resultat^6,7. Men finns det många innovativa, snabb och kvantitativa tekniker som kan ge en tillförlitlig spermier kvalitet analys^2,4.

Datorstödd spermier analys utvecklades för att erbjuda korrekta uppgifter om spermier kvalitet⁸. Denna teknik omfattar utveckling av programvara som är associerad med fas kontrast Mikroskop som gör bedömningen av spermiernas rörlighet. En begränsande faktor för motilitet parametern är dock bildhastigheten för videokameran. Enskilda spermier banor är baserade på spermier huvudet centroiden position i bildrutor av videoinspelningar, som är korrelerad med flagellar rörelse mönster^{3,9,10, 11}. de kinetiska parametrar mäts är linjär hastighet (VSL), krökt velocity (VCL) och genomsnittliga sökvägen velocity (VAP). VSL är avståndet mellan start- och slutpunkten vidtagit de spermier som dividerat med tiden. VCL är den verkliga hastigheten längs den exakta bollbana vidtagit spermier. VAP är hastigheten längs en härledd jämnas bana för bana. Dessa parametrar kan ytterligare kinetiska information, inklusive linearitet (LIN), rakhet (STR), vingla (WOB) och misshandeln mätningar som amplitud av laterala huvudrörelser (ALH) och beat-cross frekvens (BCF)^4,10.

Spermier analys systemet användes ursprungligen för däggdjursarter, och ett av kraven för systemet är att driva på kroppstemperaturen hos givaren (cirka 37 ° C). Denna programvara kan också användas för fiskarter; även om det är nödvändigt att göra vissa anpassningar för att minska felet av spermier analysresultat. I vissa fiskarter, såsom laxfiskar och ål^8,12, sker befruktning vid låg temperatur (omkring 4 ° C)^2,4. Således, kylning enheter bör utvecklas för att undvika obekväma arbetsförhållanden. Dessutom fisk spermier är orörliga i sädesvätska och kräver en osmotiska chock att aktivera motilitet. För sötvatten arter, bör aktivator mediet har hypoton osmolalitet, medan för marina arter medium bör hyperton. Men för vissa arter, kan som laxfiskar, ion koncentrationen också vara viktigt^3,4,9. Efter aktivering kännetecknas fisk spermier av en snabb minskning av motilitet (mindre än 2 min)^13,14 och hög hastighet, att vara avgörande för att bestämma den optimala hastigheten att erhålla tillförlitliga uppgifter¹⁵.

Syftet med denna studie är att utforma och tillämpa kylsystem för fisk spermier prover. Dessutom definierar detta protokoll hur att hitta de optimala bildrutehastigheter för etableringen av standardprotokoll beroende på Art. Användning av detta protokoll öppnar nya dörrar i samband med fisk seminal utvärdering, med den europeiska ålen som modell.

Protocol

Förfaranden som inbegriper djur ämnena har varit godkänd (2015/VSC/ärter/00064) av den allmänna riktningen av jordbruksproduktionen och boskap på Universitat Politècnica de València. 1. samla in spermier från mogen europeisk ål i fångenskap Obs: Använd europeisk ål hanar underhålls i tankarna med havsvatten och ett recirkulerande system vid konstant temperatur (20 ° C). Behandla med hormoner genom veckovisa intraperitoneal injektion (humant koriongonado…

Representative Results

Analys av tid effekten på spermiernas rörlighet När det gäller den europeiska ålen, procentandelen av statiska spermatozoa ökade från 15 s till 120 s efter aktivering (från 24,4% 40,7%) och andelen mobila progressiva spermier minskat (från 36,9% till 20,9%) (Figur 1A och 1B). Baserat på hastighet, spermier celler visade en minskning av hastigheten över ti…

Discussion

Spermier analys programvara som används i detta protokoll har använts av forskare som är i världen för olika arter, inklusive fisk. Fisk har dock vissa specifika funktioner som kan påverka bedömningen av spermier. Fisk spermier visade hög hastighet i ögonblicket av aktivering som minskar snabbt och leder till en kort tid av motilitet efter aktiveringen. Dessutom temperaturen av reproduktion artspecifikt och, i vissa fall kan vara runt 4 ° C^2,4,</su…

Materials

Human Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	hCG	Hormone
Benzocaine	Merck	E1501 Sigma	Anesthesia
sodium bicarbonate	Merck	S5761 Sigma	P1 medium
sodium chloride	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 medium
magnesium chloride	Merck	1374248 USP	P1 medium
potassium chloride	Merck	P3911-500G	P1 medium
calcium chloride	Merck	C7902-500G	P1 medium
commercial salt	Aqua Medic	Meersalz	Activator solution
BSA	Merck	05470 Sigma	Activator solution
Falcon tubes 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon tubes support	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µl	Gilson	PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl	Merck	Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl	Merck	Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	Counting chamber
TruMorph	PROiSER	TruMorph
Microscope UB 200i Serie	PROiSER	Microscope
Cooler plate	PROiSER		Prototype
Cooler block	PROiSER		Prototype
ISAS v1	PROiSER	ISAS	Software