الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D
Summary
مصانع النسخي الفيروسية هي هياكل منفصلة يتم إثراء الخلوية رنا بوليميراز الثاني لزيادة النسخ المورثات الفيروسية أثناء تنشيط. هنا، يتم وصف طريقة لتحديد المواقع لتدوين الكروماتين الفيروسية في الفضاء ثلاثي الأبعاد النووية بنشاط بمزيج من الفلورة التهجين الحمض النووي الريبي تلطيخ و في الموقع .
Abstract
فمن المعروف جيدا أن التنظيم المكاني والزماني للجينات جزء لا يتجزأ من الإدارة التعبير الجيني السليم. ونتيجة لذلك، فإنه لا تقدر بثمن لفهم أين ومتى يحدث النسخ داخل الفضاء النووية وتصور العلاقة بين ابيسوميس المصابة داخل نواة الخلية نفسها. هنا، كانت الفلورة (إيفا) والجيش الملكي النيبالي-الأسماك كومبينيدتو تحديد الكتابة بنشاط ابيسوميس ساركوما كابوزي المرتبطة هربس (كشف). تلطيخ كشف الكمون المرتبطة النووية مستضد (LANA)، فمن الممكن لتحديد أين توجد ابيسوميس الفيروسية داخل النواة. وبالإضافة إلى ذلك، بتصميم تحقيقات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك لاستهداف منطقة إنترون إحدى المورثات الفيروسية، التي يعبر عنها فقط أثناء العدوى الإنتاجية، يمكن وضع الوليدة رنا النصوص. استخدام هذا المزيج من المسابر الجزيئية، من الممكن تصور الجمعية للمصانع الكبيرة النسخ الفيروسية وتحليل التنظيم المكاني للتعبير الجيني الفيروسي أثناء تنشيط كشف. بها بما في ذلك مكافحة-رنا بوليميراز الثاني تلطيخ جسم واحد أيضا تصور الرابطة بين التجميع الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابي) وكشف النسخ أثناء تنشيط.
Introduction
أصبح من الواضح بشكل متزايد أن المنظمة الزمانية المكانية للنواة يلعب دوراً هاما في تحوير الجينات ضبطها بدقة في حقيقيات النوى. معظم الأنسجة جينات محددة موزعة على العديد من الصبغيات، وتحتاج إلى تنظيم شكل متزامن بغية الاستجابة للمحفزات محددة ب طريقة منسقة1. خلايا بناء محاور الكروماتين النشطة (ACH) كطريقة للجمع بين الجينات ومكوناتها التنظيمية المستقلة إلى الفضاء نووية خاصة1.
كما ثبت بالعديد من الدراسات أنه على الرغم من أن يبدو النواة كثيفة ولزجة جداً، النشيطة بيولوجيا الجزيئات يمكنها اجتياز النواة ليس بسرعة عن طريق نشر2. ونتيجة لهذه الخاصية سريعة الزوال، معظم البروتينات ربط الحمض النووي ‘القفز’ من ربط الموقع إلى ربط الموقع، شعور طريقهم نحو الفضاء النووية، الذي يسمح ب درجة عالية من التكيف وتنوعاً نواة2.
وعلى الرغم من هذا السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية داخل النواة، النووية الهيئات دون أغشية مثل (ولكن لا تقتصر على) نوية والهيئات كيال promyelocytic سرطان الدم الهيئات النووية (حزب الرابطة الإسلامية-ملحوظة) لا تزال موجودة. ومن خلال مجموعة متنوعة من الآليات مثل تكرار الحمض النووي جنبا إلى جنب (نوية)، الرنا الريباسي (نوية) والبروتينات الهيكلية مثل كوالين (الهيئات كيال) أو حزب الرابطة الإسلامية البروتينات (حزب الرابطة الإسلامية-NB) التي تحمل هذه بنيات معا3،4،5 . وهذه الهياكل والتجمعات الأخرى مثل مصانع النسخ بمثابة السقالات التي ليس فقط زيادة تركيز المحلية من المكونات المطلوبة، ولكن أيضا تنظيم تكوين البروتينات والأحماض النووية داخل كل منها في نهاية المطاف إنشاء موقع مركزي لكفاءة الوظائف الخلوية6.
تصور متى وأين شكل الهياكل النووية يوفر ثروة معلومات للباحثين الذين يدرسون التخلق. من منظور علم الفيروسات، إعادة تنشيط الفيروسات المصابة خفية، مثل كشف، يغير إلى حد كبير المناظر الطبيعية نواة وتوزيع الإنزيمات النووية لتحويل النسخ أساسا من الجينات الخلوية للمورثات الفيروسية، في نهاية المطاف إلى إنتاج ذرية فيروسية تعمل بكامل طاقتها7،8. كيفية التعامل مع كشف إليه تعبير الجينات الخلوية لتيسير التعبير الجيني الفيروسي؟ هذه المعلومات يمكن أيضا تسليط الضوء على آليات تنظيمية الجينات الخلوية الزمانية.
مثل جميع herpesviruses الأخرى، قد كشف اثنين من دورات الحياة يسمى النسخ المتماثل الحال والكمون. كشف أساسا تكمن في مرحلة الكمون، فيها معظم المورثات الفيروسية لها هو إسكات التعبير، ما عدا الكمون المرتبطة الجينات9،10. خلال الكمون تنتج كشف المرتبطة الكمون مستضد النووية (LANA)، الذي يربط الجينوم الفيروسي مؤثرا والحبال الكروماتين الفيروسية إلى الكروموسوم البشري11. بسبب العلاقة ل LANA الحميمة مع الجينوم الفيروسي، فمن الممكن استخدام DAPI وايفا لوصمة عار وتحديد موقع حيث تم ابيسوميس الفيروسية بالنسبة الكروماتين المضيف.
قد أنشئ لدراسة تنشيط كشف على مستوى واحد ابيسومي والرابطة مع أخرى ابيسوميس الفيروسية في إحدى خلايا مصابة، استراتيجية لتحديد موقع تدوين بنشاط فيروسي الكروماتين في الموقع . تبعاً لذلك، LANA وايفا رنابي مع إنترون الجيش الملكي النيبالي-الأسماك كانت مجتمعة، عن طريق توليد تحقيقات الجيش الملكي النيبالي-الأسماك التي تربط منطقة إنترون (التحقيق الدقيق يمكن الاطلاع على تسلسل في مختبر إيزومييا في منشور آخر8) ك كشف هيئة الطرق والمواصلات البروتين الفيروسي الرئيسية التي يتم ضرورية وكافية لكشف تنشيط-كان من الممكن تحديد مكان وحيثما كان بالفعل أخذ النسخ8،11،،من1213،14،15 . هذا إنترون تقنية الحمض النووي الريبي-الأسماك تمكن الباحثين تصور فيها نسخها مرناً فورا قبل أن يتم تقسم وتصديرها إلى السيتوبلازم16،17.
يمكن إعادة تنشيط كشف من المحفزات الكيميائية المختلفة بما في ذلك إستر phorbol مثل 12-س-تيتراديكونويل-فوربول-13acetate (طن سنوياً)، ويمكن أن يتسبب هيستون deacetylase مثبطات مثل بوتيرات الصوديوم، بالإضافة إلى ذلك كشف إعادة تنشيط قبل overexpression من عامل النسخ الفيروسية، كهيئه الطرق والمواصلات19. الباحثون نجحت في زيادة كفاءة كشف التنشيط بتزامن دورات للخلية قبل حمل تنشيط18. وهكذا، لهذه الدراسات، وخاصة خلايا تم مزامنة استخدام كتلة thymidine مزدوجة (البروتوكول هو موضح أدناه) والمحتضنة مع طن سنوياً والدوكسي (دوكس) لفترة قصيرة. استخدم دوكسيسيليني لأن خط الخلية المستخدمة في هذه التجارب قد كاسيت كهيئه الطرق والمواصلات الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي، التي تم استنساخ من كدنا ولا تشمل منطقة إنترون كهيئه الطرق والمواصلات. على الرغم من إمكانية إعادة تنشيط استخدام كشف فقط المستحث التعبير كهيئه الطرق والمواصلات، وقد ثبت باحثون آخرون أن سبب مجموعة متنوعة من العوامل البيوكيميائية المختلفة يثبت التعبير كهيئه الطرق والمواصلات وحدها أن تكون ضعيفة إعادة تنشيط محفزات20. عن طريق الجمع بين كل هذه، وعن طريق الحد من إينكوباتيونس المخدرات لفترة قصيرة من الزمن، وقد تحقق إعادة تنشيط كشف قوية ولكن غير مفرط اصطناعية للتصوير.
بعد وضع العلامات LANA، رنابي، introns كهيئه الطرق والمواصلات، والحمض النووي كما هو موضح في هذه الورقة، وأجرى تصوير 3D fluorescence استخدام مجهر deconvolution ويديفيلد. بعد المعالجة مع برامج التصوير، يمكن تقييم التوزيع المكاني ابيسوميس الفيروسية النشطة بشكل صحيح. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسة الأسئلة المركزية فيما يتعلق بالطبيعة الأساسية لتشكيل محاور الكروماتين النشطة وغيرها من الهياكل النووية. وبعد ابيسوميس الفيروسية متطابقة في خلية واحدة تقوم بمعالجة نفس العناصر التنظيمية قد تمثل أداة بحث فريدة من نوعها لتعميق فهم آليات تنظيمية الجينات الزمانية المكانية.
حد تصوير متعددة العينات خلية ثابتة عند نقاط زمنية مختلفة لوصف عملية جزيئية طبيعتها دينامية هو أن التغييرات خفية أو الصغيرة في توزيع الأسفار التي لم يتم كشفها أو تعتبر ضئيلة. وهذا صحيح إلا في حالة نادرة، يعرض كل خلية ولاحظ نفس التغيير خفية. وهكذا، لا يمكن العلاقة الزمانية المكانية الكاملة النشطة النسخ الفيروسية وغيرها من الهياكل النووية خطيرة تقييمه باستخدام التصوير الثابت. لمواجهة هذه التحديات التقنية، أفضل نهج للصورة الخلايا الحية التي تميزت ابيسوميس الفيروسية ومتابعة موقع الإنزيمات الخلوية الرئيسية على مر الزمن.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك بعض الجوانب للبروتوكول التي يمكن تعديلها لاستيعاب ظروف غير عادية. ويمكن أيضا تغيير خيار التثبيت و permeabilization المخازن المؤقتة. للمخازن المؤقتة للتثبيت، بارافورمالدهيد أيضا فعال ويمكن استخدام الإيثانول بيرميبيليزيشن.
تبريد الفورمالدهايد مع جليكاين يوصي برنامج تلفزيو?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من منحة “المعاهد الوطنية للصحة” (R01-DE025985) و “الأمريكية سرطان المجتمع البحث الباحث تحكيم” (RSG-13-383-MPC). وأيد هذا العمل أيضا منح من وزارة الزراعة الأمريكية (2015-67015-23268 و 2014-67015-21787) ومنحة مبادرة بحوث جديدة من جامعة كاليفورنيا في ديفيز.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Riferimenti
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
