3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング
Summary
ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D 空間での議事録作成のサイトを検索する方法を説明します。
Abstract
遺伝子の空間的で、一時的な規制が適切な遺伝子発現を支配するの不可欠な部分であることが知られています。その結果、核空間内で転写が行われて、いつどこを理解し、エピソーム同じ細胞の核内に感染との関係を視覚化するが有益です。ここでは、蛍光抗体法 (IFA) と RNA の魚をされているに転写してカポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) エピソーム総収入を識別します。KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ) を染色によってウイルス エピソームが核内に存在する検索することが可能です。さらに、生産的な伝染の間にだけ表現されるウイルス遺伝子のイントロン領域を対象とする魚 RNA プローブを設計することによって初期の RNA 転写産物に配置できます。この分子プローブの組み合わせを使用して、大規模なウイルスの転写工場の組立を視覚化および分析 KSHV 再活性化中にウイルスの遺伝子発現の空間情報の制御することが可能です。抗 RNA ポリメラーゼ II 抗体の汚損などによる RNA ポリメラーゼ II (RNAPII) の集約と再アクティブ化の間に KSHV 転写関係を視覚化することも 1 つ。
Introduction
それは核の時空間の組織が真核生物で細かく調整された遺伝子の発現を調節する際に重要な役割を果たしていることがますます明らかになっています。ほとんどのティッシュ特定の遺伝子は多くの染色体に分散されているし、調整方法1特定の刺激に応答するために同期的に規制する必要があります。細胞は、核の特定の空間1遺伝子とそのシスのコンポーネントをまとめるための方法としてアクティブなクロマチン ハブ (ACH) を構築します。
それも実証されている様々 な研究によって核思われます非常に密な粘性が、生理活性分子を経由できること核より迅速に拡散2を経由。この一時的なプロパティは、結果としてほとんどの DNA 結合タンパク質 ‘ジャンプ’ 結合により、高い適応性と汎用性の高い核2原子力の分野の周り自分の道を感じるサイトへサイトのバインドから。
核内の分子の動的挙動がこの、にもかかわらず核体膜なしなど (ただしこれらに限定されない) 核小体、カハール体および前骨髄球性白血病核体 (PML の-NB) がまだ存在します。それはタンデム DNA 繰り返し (仁)、rRNA (仁) と coilin (カハール体) など PML タンパク質などの様々 な蛋白質 (PML の-NB) これら構成要素一緒に3,4,5 を保持します。.これらの構造と転写工場など他の集会だけでなく必要なコンポーネントのローカル集中を高めるが、またタンパク質や核酸最終的に作成するそれらの内の組成を調節する足場として、効率的な細胞機能6中央のサイト。
核構造のフォームは、エピジェネティクス研究に豊富な情報を提供しますいつ、どこの可視化。ウイルス学の観点から KSHV などの潜伏感染したウイルスの再活性化大幅核の風景とウイルス遺伝子を細胞の遺伝子から主に転写を最終的にシフトする核酵素の分布を変更するには完全に機能ウイルス子孫7、8を生成します。KSHV はどのようにウイルスの遺伝子発現を促進する細胞遺伝子式機械を操作できますか。そのような情報は、細胞特異的な遺伝子発現制御機構に光を当てることができるも。
他のヘルペス ウイルスは、同様 KSHV 複製と遅延と呼ばれる 2 つのライフ サイクルがあります。KSHV は遅延関連遺伝子9,10を除いて、式の沈黙で、ほとんどのウイルスの遺伝子の潜伏段階で主に存在します。生成 KSHV 待ち時間中に待ち時間は恒常とウイルスのゲノムを縛り、人間の染色体11ウイルス クロマチンをテザー核抗原 (ラナ) を関連付けられています。ラナのウイルスのゲノムとの親密な関係のため、IFA および DAPI を使用して染色し、ウイルス エピソームがホスト クロマチンに関連していた検索することが可能です。
単一 episome レベルおよび感染細胞内の他のウイルスのエピソーム関連付けで KSHV を再活性化を勉強するには、手段を使って、積極的にその場でウイルス クロマチン転写を設置します。したがって、ラナとイントロン RNA 魚と RNAPII を対仏投資庁に結合されたは KSHV K Rta のキーのウイルス蛋白質のイントロン領域 (泉谷ラボの最新出版物8シーケンスを見つけることができます正確なプローブ) にバインド魚 RNA プローブを生成することによって不可欠と KSHV 再活性化-それは識別すること十分な転写が取っていた実際にどこの場所8,11,12,13,14,15.このイントロン RNA 魚の技術すぐに融着接続、細胞質16,17にエクスポートする前に、mRNA が転写されている視覚化することも可能。 にします。
KSHV ホルボールエステル 12-O-Tetradeconoyl-ホルボールエステル-13acetate (TPA) などを含む様々 な化学的刺激によって再びアクティブにできます、酪、さらに KSHV などヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が誘導され、過剰発現による再アクティブ化ウイルスの転写因子、K Rta19。研究者は再活性化18を誘導する前にセルのサイクルを同期することによって正常に KSHV 再活性化の効率を増加しています。したがって、これらの特定の研究は、細胞は二重チミジン ブロック (下記のプロトコル) を使用して、短時間 TPA とドキシサイクリン (Dox) インキュベートに同期されました。これらの実験に利用されている細胞株はドキシサイクリン誘導された K Rta カセットは、cDNA から複製された、K Rta のイントロン領域は含まれませんので、ドキシサイクリンが使用されました。再アクティブ化することが可能だが K Rta 式を誘導 KSHV を使用してのみ、それは、さまざまな異なる生化学的要因により K Rta 式だけがかすかな再活性化刺激20と証明する他の研究者によって証明されています。これらのすべてを組み合わせることで、薬物孵化に時間の短い期間を制限することにより、イメージングの堅牢な過度に人工的ではない KSHV 再活性化が達成されました。
ラナ、RNAPII、ラベリング後 K Rta イントロンととしての DNA は、このペーパーで説明、広視野デコンボリューション顕微鏡を用いた 3 D 蛍光イメージングを行った。イメージング ソフトウェアとの処理の後は、アクティブなウイルス エピソームの空間分布を正しく評価できます。この手法を使用すると、アクティブなクロマチン ハブやその他の核構造の形成の基本的な性質に関する中央の質問を学ぶことができます。同じ規制要素を処理する単一のセルに同じウイルス エピソームを持つ時空間の遺伝子発現制御機構の理解を深めるためのユニークな研究ツールがあります。
異なる時点で固定する複数の細胞標本が、本質的に動的分子プロセスを特徴付けるためのイメージングの制限事項は蛍光分布の微妙なあるいは小規模の変化が検出されているまたは取るに足りないと判断します。これはまれなインスタンスの観察のすべてのセルが同じの微妙な変化を表示されない場合です。したがって、アクティブなウイルスの転写およびその他の核構造の全時空間関係批判的に評価できません固定のイメージングを使用します。これらの技術的な課題に対応するには、最善の方法は、ウイルス エピソームをマークしている生きた細胞をイメージし、時間の経過とともに細胞の主要な酵素の場所に従うことです。
Protocol
Representative Results
Discussion
異常な状況に合わせて変更することができますプロトコルのいくつかの側面があります。固定・透過バッファーの選択を変更することも。固定バッファーのパラホルムアルデヒドも効果的で、透過性のエタノールを使用ことができます。
ホルムアルデヒドがウシ血清アルブミン (BSA) の不在で抗体を無効にするを防ぎますが、グリシンの PBS のステップをスキップできま?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所の助成金 (R01 DE025985)、アメリカ癌協会の研究学者賞 (RSG-13-383-MPC) にサポートされていました。この作品もによって支えられた米国農務省の (2015-67015-23268 と 2014-67015-21787) とカリフォルニア大学から新しい研究イニシアティブ助成金からの助成金・ デイヴィス。
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Riferimenti
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