Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D
Summary
Fábricas transcripcionales virales son estructuras discretas que se enriquecen con celular polimerasa de ARN II para aumentar la transcripción de genes virales durante la reactivación. Aquí, se describe un método para localizar sitios de transcripción activamente de cromatina viral en el espacio 3D nuclear por una combinación de la hibridación de RNA en situ y tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
Es bien sabido que la regulación espacial y temporal de los genes es una parte integral de expresión génica adecuada de gobernar. En consecuencia, es valioso comprender dónde y cuándo transcripción tiene lugar en el espacio nuclear y visualizar la relación entre episomas infectados dentro de núcleo de la célula misma. Aquí, han sido la inmunofluorescencia (IFA) y RNA-peces combinedto identificar activamente transcribir episomas herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV). Manchando de antígeno nuclear asociado a latencia KSHV (LANA), es posible localizar donde existen episomas virales dentro del núcleo. Además, mediante el diseño de sondas de RNA-pescado a la región del intrón de un gen viral, que se expresa sólo durante la infección productiva, transcritos de RNA nacientes pueden ser situados. Utilizando esta combinación de sondas moleculares, es posible visualizar el montaje de fábricas de transcripción viral grande y analizar la regulación espacial de expresión génica viral durante la reactivación de KSHV. Incluyendo tinción de anticuerpo anti-ARN polimerasa II, uno puede también visualizar la asociación entre la agregación de la ARN polimerasa II (RNAPII) y transcripción de KSHV en la reactivación.
Introduction
Se ha vuelto cada vez más claro que la organización espaciotemporal del núcleo desempeña un papel importante en la modulación de la expresión génica finamente sintonizada en eucariotas. Más genes específicos de tejido son distribuidos en muchos cromosomas y necesitan ser regulado sincrónicamente con el fin de responder a estímulos específicos en una forma coordinada1. Las células construyen núcleos de cromatina activa (ACH) como una forma de reunir a los genes y sus componentes cis-reguladoras a un específico espacio nuclear1.
También se ha demostrado por diversos estudios que aunque el núcleo parece muy denso y viscoso, moléculas biológicamente activas pueden atravesar el núcleo bastante rápidamente a través de la difusión2. Como consecuencia de esta propiedad efímera mayoría proteínas ADN ‘jump’ de enlace sitio obligatorio sitio, sintiendo su camino alrededor del espacio nuclear, que permite que un núcleo altamente adaptable y versátil2.
A pesar de este comportamiento dinámico de biomoléculas dentro del núcleo, nucleares cuerpos sin membranas tales como (pero no limitado a) nucleolo, cuerpos de Cajal los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica (PML NB) todavía existen. Es a través de una variedad de mecanismos tales como repeticiones en tándem DNA (nucleolo), ARNr (nucleolo) y proteínas estructurales como coilina (cuerpos de Cajal) o LMP proteínas (PML NB) que estas construcciones junto3,4,5 . Estas estructuras y otras congregaciones como fábricas de transcripción sirven como andamios que no sólo incrementan la concentración local de componentes requeridos, sino que también regulan la composición de proteínas y ácidos nucleicos dentro de ellos, en definitiva, crear un sitio central para las funciones celulares eficiente6.
Visualizar cuando y donde forma estructuras nucleares ofrece una gran cantidad de información a los investigadores estudiar la epigenética. Desde una perspectiva de la virología, la reactivación del virus latente infectados, como KSHV, altera significativamente el paisaje del núcleo y distribución de enzimas nucleares cambiar transcripción principalmente de genes celulares a genes virales, en última instancia a producir la progenie viral completamente funcional7,8. ¿KSHV manipular la maquinaria de expresión de genes celulares para facilitar la expresión del gen viral? Dicha información también podría arrojar luz sobre mecanismos de regulación génica celular temporal.
Como todos otros herpesviruses, KSHV tiene dos ciclos de vida se llama latencia y replicación lítica. KSHV reside principalmente en la etapa de latencia, en que la mayor parte de su gen viral expresión es silenciada, menos latencia asociados genes9,10. Durante la latencia que KSHV produce latencia asociada antígeno nuclear (LANA), de la que constitutivamente se une los genomas virales y correas cromatina viral en el cromosoma humano11. Debido a la íntima relación de LANA con el genoma viral, es posible utilizar IFA y DAPI mancha y ubicar donde estaban los episomas virales en relación con la cromatina de host.
Para estudiar la reactivación de KSHV episome sola y la asociación con otros episomas virales en una célula infectada, se ha establecido una estrategia para localizar transcribiendo activamente cromatina viral en situ . Por consiguiente, LANA y RNAPII IFA con intrón RNA-peces fueron combinados, mediante la generación de sondas de RNA-peces que se unen a la región del intrón (sonda exacta secuencias pueden encontrarse en más reciente publicación8 del laboratorio Izumiya) de la proteína viral clave K KSHV-Rta-el que es esencial y suficiente para la reactivación de KSHV-era posible identificar en su transcripción se toma colocar8,11,12,13,14,15 . Este intrón técnica FISH RNA permite a los investigadores visualizar donde ARNm se transcribe inmediatamente antes de empalmar y exportado al citoplasma16,17.
KSHV puede ser reactivado por varios estímulos químicos como ésteres de forbol como el 12-O-Tetradeconoyl-forbol-13acetate (TPA) e inhibidores de histona deacetilasa como butirato, además KSHV pueden ser inducidos a reactivar por la sobreexpresión de el factor de la transcripción viral, K-Rta19. Los investigadores han aumentado con éxito la eficacia de la reactivación de KSHV sincronizando los ciclos de la célula antes de inducir la reactivación18. Así, para estos estudios en particular, las células fueron sincronizadas mediante un bloque doble timidina (Protocolo se describe a continuación) y se incubaron con TPA y doxiciclina (Dox) por un corto tiempo. Doxycyline se utilizó debido a que la línea celular utilizada en estos experimentos tiene un cassette K Rta doxiciclina-inducible, que fue reproducido de cDNA y no incluye la región del intrón de K-Rta. Aunque es posible reactivar KSHV usando sólo había inducido expresión K-Rta, se ha comprobado por otros investigadores que debido a una variedad de factores bioquímicos diferentes expresión K Rta solo demuestra para ser una reactivación débil estímulos20. Mediante la combinación de todos ellos y limitando las incubaciones de drogas en un corto período de tiempo, se logró una reactivación de KSHV robusta pero no demasiado artificial para la proyección de imagen.
Después de etiquetar LANA, RNAPII, K-Rta introns y ADN como se describen en este artículo, imágenes 3D de la fluorescencia se realizaron utilizando un microscopio de deconvolución de campo amplio. Después de procesar con software de imágenes, puede evaluarse adecuadamente la distribución espacial de episomas virales activos. Con esta técnica se pueden estudiar las cuestiones centrales sobre la naturaleza fundamental de la formación de núcleos de cromatina activa y otras estructuras nucleares. Tener idénticos episomas virales en una sola célula que procesa los mismos elementos regulatorios puede representar una herramienta de investigación único para profundizar en el conocimiento de mecanismos de regulación del gene espaciotemporal.
Una limitación de múltiples muestras celulares fijadas en diferentes puntos temporales para caracterizar un proceso inherentemente dinámico molecular de la proyección de imagen es que sutil o pequeños cambios en la distribución de la fluorescencia son detectados o considerado como insignificantes. Esto es cierto a menos que en el caso raro, cada célula observada muestra el mismo cambio sutil. Así, la relación espaciotemporal completo de transcripción viral activa y otras estructuras nucleares no puede ser críticamente evaluada usando proyección de imagen fija. Para hacer frente a estos retos técnicos, el mejor enfoque es células vivas imágenes que han marcado episomas virales y para seguir la localización de enzimas claves del celulares con el tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay algunos aspectos del protocolo que pueden modificarse para adaptarse a circunstancias inusuales. También se puede alterar la elección de los búferes de fijación y permeabilización. Para los búferes de fijación, paraformaldehido es también eficaz y etanol puede ser utilizado para permeabilización.
Amortiguamiento el formaldehído con glicina que PBS se recomienda ya que previene formaldehído de desactivar los anticuerpos en ausencia de albúmina de suero bovino (BSA), pero si el c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por donaciones de institutos nacionales de salud (R01-DE025985) y por un cáncer americano sociedad Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Este trabajo fue apoyado por becas del Departamento de agricultura de Estados Unidos (2015-67015-23268 y 2014-67015-21787) y nueva subvención de iniciativa de investigación de la Universidad de California, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Riferimenti
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