Manipulação e tratamento de macho Europeu enguias (Anguilla anguilla) para maturação Hormonal e criopreservação de esperma
Summary
Protocolos de criopreservação de maturação e esperma de enguia Europeia foram melhorados nos últimos anos. Este artigo descreve o melhor protocolo disponível usando gonadotrofina coriônica humana (hCG) para induzir a maturação e metanol como crioprotetor.
Abstract
Durante os últimos anos, diversos grupos de pesquisa têm trabalhado no desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos protocolos para o tratamento de enguia europeia e maturação. A partir de ainda, injeções semanais de gonadotrofina coriônica humana (hCG) demonstraram maturate machos após apenas 5-6 semanas de tratamento, produzindo grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade durante várias semanas. Além disso, protocolos de criopreservação de esperma usando diferentes extensores, crioprotectores e refrigeração e descongelamento vezes foram anteriormente descritas para a enguia europeia. Aqui, nós mostramos que solução de extensor de Tanaka´s pode ser usada diretamente para a fertilização ou para criopreservação, tornando desnecessária a utilização de diferentes tipos de soluções e diluições. Além disso, o uso do metanol como um crioprotetor faz este protocolo fácil de usar como metanol tem baixa toxicidade e não ativa o esperma. O esperma não precisa ser criopreservado imediatamente após a adição do crioprotetor, e pode ser usado muito tempo depois de ser descongelado. Além disso, é ainda alta motilidade espermática pós-descongelação embora seja menor do que de esperma fresca. O objetivo deste trabalho é mostrar o melhor protocolo disponível para a enguia europeia, manipulação, maturação e criopreservação de esperma.
Introduction
Nos últimos 25 anos, o número da enguia europeia (Anguilla anguilla) chegando no litoral europeu diminuíram progressivamente 90% 1,2,3. Existem vários fatores que explicam essa queda drástica, incluindo a poluição, infecções, destruição de sobrepesca e habitat. Tudo isso teve um efeito profundo sobre esta espécie, levando à inclusão da enguia europeia na União Internacional para a lista de conservação da natureza (IUCN) como em perigo crítico 4. Consequentemente, o desenvolvimento de técnicas e protocolos para a reprodução em cativeiro são necessárias.
A maturação da enguia europeia em cativeiro é alcançada pelo tratamento hormonal 5,6,7 , mas a produção de gametas em ambos os sexos é difícil sincronizar a 8. Mesmo que o desenvolvimento de novos implantes de andrógeno tem mostrado para acelerar a ovogênese em enguias 9,10, o tempo de maturação final nas fêmeas ainda é altamente variável e difícil de controlar 11. Portanto, a curto prazo armazenamento de esperma 12,13,14 e criopreservação técnicas são necessárias para a gestão da reprodução, tornando o gameta sincronização desnecessária 8.
Criopreservação de esperma de enguia europeia tem sido desenvolvida desde 2003 15,16. Vários pesquisadores projetado protocolos bem sucedidos usando dimetilsulfóxido (DMSO) ou metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Embora ambos os protocolos têm sido utilizados com sucesso, a viabilidade de células obtidas de espermatozoides descongelados criopreservadas com DMSO é inferior com metanol 20,21. Além disso, a enguia esperma é ativada em contato com DMSO e requer mais tedioso esperma manipulação 19, portanto o metanol é um crioprotetor mais adequado para que o esperma de enguia europeia que DMSO.
Aqui, o protocolo de tratamento ideal e tratamento hormonal da enguia europeia será descrito abaixo. Além disso, o melhor protocolo de criopreservação de esperma de enguia europeia utilizando metanol como um crioprotetor e um protocolo para a avaliação da qualidade do esperma nesta espécie também será descrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o processo completo para criopreservação de esperma, a manipulação e a maturação de enguia europeia. As condições de criação descritas aqui são ideais para rápida maturação e produção de grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade nesta espécie 6,7,25. O sucesso do presente protocolo de criopreservação e seu uso potencial para a fertilização pós-descongelação dependem gran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta publicação foi financiada pela pesquisa de Horizonte 2020 da União Europeia e o programa de inovação no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 642893 (IMPRESS), o escritório de custo (custo de ação FA 1205, AQUAGAMETE) e o centro de excelência em pesquisa- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
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