Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's
Summary
Hier presenteren we een eenvoudige methode om te kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in embryonale zebrafish. HSPCs van gedissocieerde zebrafish zijn verguld in methylcellulose met ondersteunende factoren, differentiëren in volwassen bloed. Hierdoor kan de detectie van bloed gebreken en kunt drug screening om te gemakkelijk worden uitgevoerd.
Abstract
Haematopoiese is een essentiële cellulaire proces waarin onderscheid hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) in de veelheid van andere cel lineages waaruit volwassen bloed. Isolatie en identificatie van deze HSPCs is moeilijk, omdat ze zijn gedefinieerde ex post facto; zij kunnen pas worden gedefinieerd nadat hun differentiatie in bepaalde cel geslachten. In de afgelopen decennia, is de zebravissen (Danio rerio) een model-organisme om te studeren van Haematopoiese geworden. Zebravis embryo’s ontwikkelen ex utero, en door 48 h na bevruchting (hpf) hebben gegenereerd definitieve HSPCs. testen om te beoordelen HSPC differentiatie en proliferatie vermogens hebben ontwikkeld, gebruik makend van transplantatie en de daaropvolgende reconstructie van het hematopoietische systeem naast het visualiseren van gespecialiseerde transgene lijnen met confocale microscopie. Deze tests zijn echter kosten onbetaalbaar, technisch gezien moeilijk en tijdrovend voor veel laboratoria. Ontwikkeling van een in vitro model te beoordelen van de HSPCs zou rendabele, sneller, en huidige minder problemen in vergelijking met de eerder beschreven methoden, waardoor laboratoria te snel beoordelen mutagenese en drug schermen die invloed hebben op HSPC biologie. Deze roman in vitro assay voor het beoordelen van de HSPCs wordt uitgevoerd door de beplating los gezien hele zebrafish embryo’s en toevoegen exogene factoren die alleen HSPC differentiatie en proliferatie te bevorderen. Embryo’s worden losgekoppeld in afzonderlijke cellen en verguld met HSPC-ondersteunend kolonie stimulerende factoren die ervoor zorgen ze dat voor het genereren van de kolonie vormende eenheden (CFUs) die uit een enkele progenitor cel voortvloeien. Deze testen zou meer zorgvuldig onderzoek van de moleculaire pathways verantwoordelijk voor HSPC proliferatie, differentiatie, en verordening, waarmee onderzoekers te begrijpen van de onderbouwing van gewervelde Haematopoiese en de disregulatie tijdens ziekte.
Introduction
Haematopoiese is het proces van het maken van de veelheid van rijpe bloedcellen die nodig is voor de overleving van een organisme. Het is een belangrijke developmental proces waarbij de differentiatie van hematopoietische stamcellen (HSCs) in een verscheidenheid van verstandelijk beperkte celtypes waaruit volwassen bloed. Deze HSCs moeten zelf vernieuwen zodat het systeem nooit uitgeput is en ze van vroege embryonale ontwikkeling tot dood aanhouden moeten. In gewervelde dieren, constante differentiatie en proliferatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) zijn nodig voor voldoende vullen de meerderheid van de bloedcellen die post mitotische zijn en elke dag worden gerecycled. HSCs genereren volwassen bloedcellen door de eerste differentiëren in subsets van beperkte voorlopercellen; gemeenschappelijke lymfoïde progenitoren (CLPs)1, die uiteindelijk produceren T, B en NK-cellen, en gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs)2 die het genereren van Granulocyten, erytrocyten, macrofagen en megakaryocytes. Deze progenitoren zich inzetten voor het genereren van specifieke cel geslachten, en verder onderscheiden in meer verstandelijk beperkte voorlopercellen zoals myeloïde erythroid progenitoren (Europarlementariërs) die het genereren van erytrocyten en bloedplaatjes of granulocyt macrophage progenitoren (GGP’s) die het genereren van basofielen, eosinofielen, neutrofielen en macrofagen2. Identificeren en het isoleren van deze progenitoren maakt de identificatie van belangrijke moleculaire pathways betrokken bij hematopoietische differentiatie en vele hematopoietische ziekten zoals leukemie ontstaan bij deze voorlopercellen niet goed onderscheiden.
In de afgelopen decennia, is het systeem van zebravissen (Danio rerio) model een belangrijke onderzoeksinstrument voor embryonale en volwassen hematopoietische studies geworden. Zebravis zijn vatbaar voor genetische analyse en de fylogenetisch laagste gewervelde model soorten die een vergelijkbare therapieën en hematopoietische systeem voor de mens hebben. Zebravis embryo’s ontwikkelen ex utero, en binnen 48 uur bericht genereren bevruchting (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebravis zijn ook zeer vruchtbare, met vrouwtjes leggen over 100 eieren in een interne koppeling, waardoor voor grote steekproeven en experimentele replicatie. Zebravis embryo’s zijn optisch transparant, waardoor voor microscopische visualisatie van het hematopoietische systeem. Enkele fluorescerende transgene coderegels zebrafish markering HSCs zoals runx1: EGFP vissen9, cd41: EGFP vissen10, en kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dubbel-positieve dieren, voorzien van live, real-time visualisatie van HSC ontstaan en de uitbreiding in vivo3,4,7,8, 9. Van de zebravis snelle generatie tijd en ontwikkeling ex utero heeft geleid tot het gebruik ervan in de mutagenese studies11,12,13,14,15 en drug screening16,17,18,19,20 voor verbindingen die houden van therapeutische belofte voor menselijk bloed stoornissen. Globaal, instandhouding van het hematopoietische systeem, de aanwezigheid en eenvoudige ontwikkeling van transgene lijnen en snelle regeneratietijd geboekt de zebravis een goedkoop, snel, flexibel en ideaal model voor hematopoietische studies.
Tal van methoden van isoleren en testen van HSCs zijn in zoogdieren hematopoietische systemen ontwikkeld. Onderzoekers kunnen gebruik maken van een combinatie van cel oppervlakte receptoren aan mark van HSCs21,22,23,24, evenals het benutten van het vermogen van HSCs om efflux kleurstof25,26. Nadat ze zijn aangeduid, kan fluorescentie-activated cell sorting (FACS) hun fysieke scheiding. Waaruit blijkt dat een cel een HSC is vereist het bestralen van een dier van de gastheer te vernietigen van endogene HSPCs, overplanten van vermeende HSCs, en op lange termijn, multi lineage reconstitutie van alle oudere bloed celtypes observeren. Deze testen werken goed in muizen, want er zijn talrijke celoppervlak antilichamen tegen hematopoietische cellen en muis ingeteelde stammen die vergemakkelijken immuun matching voor transplantatie. Echter, zijn paar zebrafish hematopoietische celoppervlak antilichamen gegenereerde27, belemmeren de identificatie en de isolatie van de HSCs. De meest gebruikelijke manier om te markeren en te isoleren van de zebravis HSCs is met transgene dieren, waarbij een reeks van cel-specifieke promotor is het besturen van een fluorescerende eiwit expressie. Studies hebben gevisualiseerd en HSCs in de ventrale muur van de dorsale aorta opgesomd met microscopie met behulp van deze techniek3,4,8,9. Andere laboratoria hebben gegenereerd klonale stammen van zebravis28,29 en succesvolle transplantaties in MHC-matched dieren30hebben uitgevoerd. Echter deze technieken worden kosten onbetaalbaar met veel laboratoria zijn technisch gezien moeilijk en tijdrovend zijn. Om deze kwesties te behandelen, hebben laboratoria gegenereerd verscheidene in vitro testen om te testen voor de aanwezigheid, de proliferatie-tarieven en de capaciteit van de differentiatie van HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Deze onderzoeken tonen de proliferatie en differentiatie van HSPCs in vitro31,32,33,34,35,,36, de redding van hematopoietische gebreken36, en een efficiënte methode voor het ontdekken en testen van cytokines33,34,35. Ze hebben ook gebruikt ter identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor31,32van de biologie van de HSPC. In deze studie nemen wij deze testen een stap verder, waardoor de kwantificatie van HSPCs in een zich ontwikkelende zebrafish embryo. Deze testen kunnen ook worden gebruikt om het kwantificeren van het aantal HSPCs in mutant dieren en dieren behandeld met hematopoietische-ontwrichtende drugs. Kortom, deze tests zijn snel, huidige enkele technische uitdagingen, en goedkope manieren om te kwantificeren HSPC nummers, hun verspreiding te onderzoeken en onderzoeken van blokken in differentiatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zebravis modelsysteem is een efficiënte, effectieve en goedkope model voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde Haematopoiese geworden. Generatie van tests die zijn snel, goedkoop, en enkele technische moeilijkheden opleveren kan worden gebruikt voor het testen van kleine molecules, analyseren van mutant embryo’s en het ophelderen van de moleculaire pathways belangrijk voor HSPC biologie. In vitro beplating van HSPCs van volwassen zebrafish is een effectieve methode om te studeren mutagene…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 naar D.L.S.), de California State University Program voor onderwijs & onderzoek in de biotechnologie (CSUPERB: Moleculaire controle van de gewervelde hematopoietische Niche te D.L.S.) en vanuit het kantoor van de Graduate Studies in California State University Chico (op A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
Riferimenti
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
