Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata
Summary
Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l’ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.
Abstract
Come una promettente piattaforma di editing del genoma, il sistema CRISPR/Cas9 ha un grande potenziale per la manipolazione genetica efficiente, soprattutto per l’integrazione mirata dei transgeni. Tuttavia, a causa della scarsa efficienza di ricombinazione omologa (HR) e le varie mutazioni indel di non-omologo fine unirsi (NHEJ)-basato su strategie in cellule di divisione, in vivo genome pubblica rimane una grande sfida. Qui, descriviamo una fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-CRISPR/Cas9 sistema efficiente in vivo precisa mirata integrazione basato. In questo sistema, il genoma mirato e il donatore vector contenente armi di omologia (~ 800 bp) fiancheggiato da destinazione di RNA (sgRNA) guida singola sequenze sono spaccate da CRISPR/Cas9. Questa strategia basata su HMEJ realizza integrazione efficiente transgene in zigoti del mouse, così come in epatociti in vivo. Inoltre, una strategia basata su HMEJ offre un approccio efficace per la correzione di fumarylacetoacetate idrolasi (Fah) mutazione negli epatociti e Salva Fah-deficit indotto da topi di insufficienza epatica. Presi insieme, concentrandosi su mirata integrazione, questa strategia basata su HMEJ fornisce uno strumento promettente per una varietà di applicazioni, inclusa la generazione di modelli animali geneticamente modificati e terapie geniche mirate.
Introduction
L’editing genomico precisa, mirata è spesso necessaria per la produzione di modelli animali geneticamente modificati e terapie cliniche. Molto sforzo è stato fatto per sviluppare varie strategie per efficiente genoma mirata modifiche, ad esempio l’apparato nucleasi a dita zinco (ZFN), nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALENs) e sistemi di CRISPR/Cas9. Queste strategie creare rotture a doppio filamento del DNA mirate (DSB) nel genoma e trarre vantaggio intrinseci sistemi di riparazione del DNA, come ricombinazione omologa (HR)1,2, basi-mediata fine unirsi (MMEJ)3 , 4 , 5e alla fine non-omologo unendo (NHEJ)6,7,8 per indurre l’integrazione mirata di transgeni1,9. La strategia basata su HR è attualmente il più comunemente usato genoma modificando l’approccio, che è molto efficiente in linee cellulari, ma non prontamente accessibile alle cellule di divisione a causa del relativo avvenimento limitata verso la fine della fase S/G2. Così, la strategia basata sulla non è applicabile per in vivo l’editing genomico. Recentemente, la strategia basata su NHEJ è stata sviluppata per efficiente gene knock-in mouse tessuti8. Tuttavia, il metodo basato su NHEJ introduce solitamente indels alle giunzioni, rendendo difficile generare l’editing genomico preciso, soprattutto quando si tenta di costruire in-frame fusione geni8. Integrazione mirata basata su MMEJ è capace di editing preciso genomico. Tuttavia, solo modestamente aumenta l’efficienza di integrazione mirata in precedenti relazioni5. Di conseguenza, migliorare l’efficienza della precisa integrazione mirata in vivo è urgente per applicazioni terapeutiche ampio3.
In un lavoro pubblicato recentemente, abbiamo dimostrato un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia, che ha mostrato la massima efficienza di integrazione mirata a tutti segnalati strategie sia in vitro che in vivo10. Qui, descriviamo un protocollo per l’istituzione del sistema HMEJ, e anche la costruzione dei vettori di RNA (sgRNA) singolo-guida il gene di interesse e il donatore di targeting vettori harboring siti di destinazione sgRNA e ~ 800 bp di braccia di omologia (Figura 1) . In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata per la generazione di topi knock-in DNA e brevi passi per l’integrazione mirata in tessuti in vivo. Inoltre, uno studio di proof-of-concept della strategia basata su HMEJ dimostrato la sua capacità di correggere Fah mutazione e salvare Fah– / – fegato guasto topi, che ulteriore ha rivelato il suo potenziale terapeutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici nella costruzione di plasmidi di donatore HMEJ sono: (1) selezione di sgRNA con alta efficienza di clivaggio del DNA e bassa distanza tra sito di taglio sgRNA e codone di arresto e costruzione (2) corretta del donatore HMEJ. CRISPR/Cas9-mediata cleavage su entrambi vettoriale di donatore del transgene (contenente siti di destinazione sgRNA e ~ 800 bp omologia braccia) e genoma mirato è necessario per l’integrazione mirata efficiente e precisa in vivo. I passaggi più critici della genera…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da CAS strategico priorità Research Program (XDB02050007, XDA01010409), la nazionale Hightech di R & D programma (programma 863; 2015AA020307), National Natural Science Foundation of China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth mille talenti programma (HY), rottura attraverso il progetto dell’Accademia delle scienze cinese, Shanghai città comitato della scienza e della tecnologia del progetto (16JC1420202 a HY), il Ministero della scienza e della tecnologia della Cina (la maggior parte; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
Riferimenti
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