CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi
Summary
De klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR tilknyttet protein 9 (CRISPR/Cas9) gir et lovende verktøy for genteknologi, og åpner opp muligheten for målrettet integrasjon av effekter av transgener. Vi beskriver en homologi-mediert slutt begynte (HMEJ)-basert strategi for effektiv DNA målrettet integrering i vivo og målrettet gen-terapi bruker CRISPR/Cas9.
Abstract
Som en lovende genomet redigering plattform har CRISPR/Cas9 systemet stort potensial for effektiv genetisk manipulasjon, spesielt for målrettet integrering av effekter av transgener. Men på grunn av lav effektiviteten av homologe rekombinasjon (HR) og ulike indel mutasjoner av ikke-homologe begynte (NHEJ)-basert strategier i ikke-dele celler, i vivo genomet redigering er fortsatt en stor utfordring. Her beskriver vi en homologi-mediert slutt begynte (HMEJ)-basert CRISPR/Cas9 system for effektiv i vivo presis målrettet integrering. I dette systemet, målrettet genomet og donor vektor inneholder homologi armene (~ 800 bp) flankert av enkelt støttelinje RNA (sgRNA) mål sekvenser er kløyvde av CRISPR/Cas9. Denne HMEJ-basert strategi oppnår effektiv transgene integrering i musen zygotes, samt i hepatocytter i vivo. Dessuten en HMEJ-basert strategi tilbyr en effektiv fremgangsmåte for korreksjon av fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutasjon i hepatocytter og redder Fah-mangel indusert leversvikt mus. Sammen med fokus på målrettet integrasjon, denne HMEJ-basert strategi gir et lovende verktøy for en rekke applikasjoner, inkludert generasjon av genmodifiserte dyr modeller og målrettet gen-terapi.
Introduction
Presis, målrettet genomet redigering er ofte nødvendig for å produsere genmodifiserte dyr modeller og klinisk behandling. Mye innsats har blitt gjort å utvikle ulike strategier for effektiv målrettet genomet redigering, for eksempel sink finger nuclease (ZFN), transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs), og CRISPR/Cas9 systemer. Disse strategiene opprette målrettede DNA dobbel-strand bryter (DSB) i genomet, og dra nytte av innebygd DNA reparasjon systemer, for eksempel homologe rekombinasjon (HR)1,2, microhomology-mediert slutten med (MMEJ)3 , 4 , 5og ikke-homologe slutt begynte (NHEJ)6,7,8 å indusere målrettet integrering av effekter av transgener1,9. Den HR-basert strategien er mest brukte genomet redigering tilnærming, som er svært effektiv i linjer, men ikke lett tilgjengelig for ikke-dele celler på grunn av begrenset forekomst i slutten S/G2 fase. Dermed er den HR-basert strategien ikke tilgjengelig for i vivo genomet redigering. Nylig ble den NHEJ-basert strategien utviklet for effektiv genet banke i musen vev8. Likevel introduserer metoden NHEJ-baserte vanligvis indeler ved veikryss, gjør det vanskelig å generere nøyaktige genomet redigering, særlig når prøver å konstruere i-ramme fusion gener8. MMEJ-baserte målrettede integrering er i stand til nøyaktig genomet redigering. Det øker imidlertid bare beskjedent målrettet integrering effektiviteten i tidligere rapporter5. Derfor er effektivisering av presise målrettet integrering i vivo sterkt behov for bred terapeutiske programmer3.
I en nylig publisert arbeid, vi viste en homologi-mediert slutt begynte (HMEJ)-basert strategi, som viste den høyeste målrettet integrering effektiviteten i alle rapporterte strategier både i vitro og vivo10. Her beskriver vi en protokoll for etablering av HMEJ, og også byggingen av enkelt-guide RNA (sgRNA) vektorer målretting genet av interesse og donor vektorer harboring sgRNA målområder og ~ 800 bp homologi våpen (figur 1) . I denne protokollen beskriver vi også detaljerte trinn for generering av DNA banke i mus og informere skritt for målrettet integrering i vev i vivo. Videre vist en proof-of-concept studie av den HMEJ-basert strategien sin evne til å rette Fah mutasjon og redde Fah– / – leveren feil mus, som videre avslørt sitt terapeutiske potensial.
Protocol
Representative Results
Discussion
De viktigste trinnene i konstruksjonen av HMEJ donor plasmider er: (1) utvalg av sgRNA med høy DNA cleavage effektivitet og lave avstanden mellom sgRNA kutte området og stoppe codon, og (2) riktige bygging av HMEJ donor. CRISPR/Cas9-mediert cleavage på begge transgene donor vektor (inneholder sgRNA målområder og ~ 800 bp homologi armene) og målrettet genom er nødvendig for effektiv og presis målrettet integrering i vivo. De viktigste trinnene av generasjon av banker i mus med metoden HMEJ-baserte er: (1)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av CAS strategiske prioritet Research Program (XDB02050007, XDA01010409), den nasjonale Hightech R & D Program (863 Program, 2015AA020307), National Natural Science Foundation i Kina (NSFC gir 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Kina ungdom tusen talenter Program (til HY), Break gjennom prosjektet av kinesiske Academy of Sciences, prosjekt Shanghai byen komité for vitenskap og teknologi (16JC1420202 til HY), departementet for vitenskap og teknologi i Kina (de fleste; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
Riferimenti
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
