Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole normalisé détaillé du séquençage de haut débit 16 s rRNA-amplicon. Le protocole introduit un protocole intégré, en uniforme, possible et peu coûteux à partir de prélèvement d’échantillons fécaux au moyen d’analyses de données. Ce protocole permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons contenant des normes rigoureuses et plusieurs contrôles.
Abstract
Le microbiome humain intestinal joue un rôle central dans la protection des cellules contre les blessures, dans le traitement de l’énergie et des nutriments et dans la promotion de l’immunité. Écarts par rapport à ce qui est considéré comme une composition de la microflore saine (dysbiose) peuvent altérer les fonctions vitales conduisant à des conditions pathologiques. Des recherches récentes et en cours ont été dirigées vers la caractérisation des associations entre la composition microbienne et la santé humaine et la maladie.
Percées dans les technologies de séquençage haut débit permettent de caractériser la composition microbienne de l’intestin. Ces méthodes incluent 16 s rRNA-amplicon séquençage et le séquençage de fusil de chasse. 16 s rRNA-amplicon séquençage sert à profil composition taxonomique, tandis que le séquençage de fusil de chasse fournit des informations supplémentaires sur les prédictions de gène et d’annotation fonctionnelle. Un avantage en utilisant une méthode de séquençage ciblé de la région variable du gène 16 s ARNr est son coût nettement inférieur par rapport au séquençage de fusil de chasse. Différences de séquence dans le gène de l’ARNr 16 s sont utilisés comme une empreinte digitale microbienne pour identifier et quantifier les différents taxons au sein d’un échantillon individuel.
Efforts internationaux majeurs ont fait appel à des normes pour l’ordonnancement de 16 s rRNA-amplicon. Toutefois, plusieurs études signalent une source commune de variation causée par l’effet du traitement par lots. Pour minimiser cet effet, des protocoles en uniforme pour le prélèvement d’échantillons, le traitement et le séquençage doivent être implémentée. Ce protocole propose l’intégration des protocoles largement utilisés à partir de prélèvement d’échantillons fécaux à des analyses de données. Ce protocole comprend une approche directe-PCR sans colonne, qui permet le traitement simultané et extraction de l’ADN d’un grand nombre d’échantillons de matières fécales, ainsi que de l’amplification par PCR de la région de V4. En outre, le protocole décrit le pipeline de l’analyse et fournit un script en utilisant la dernière version de QIIME (2 QIIME version 2017.7.0 et DADA2). Ce protocole étape par étape vise à guider ceux qui s’intéressent à amorcer l’utilisation du séquençage amplicon-ARNr 16 s de façon robuste, reproduction, facile à utiliser, détaillée.
Introduction
Concentré efforts ont été faits afin de mieux comprendre la diversité microbiome et l’abondance, sous un autre aspect de capturer la différence et les similitudes entre les individus dans des conditions saines et pathologiques. Âge2,3, géographie4, mode de vie5,6et5 de la maladie se sont avérées être associé à la composition de la microbiome du tube digestif, mais beaucoup de troubles et les populations n’ont pas encore été entièrement caractérisé. Récemment, il a été signalé que le microbiome peut être modifié pour des applications thérapeutiques7,8,9. Des indications supplémentaires sur la relation entre les diverses conditions physiologiques et la composition microbienne sont donc la première étape vers l’optimisation des modifications futures possibles.
Les méthodes traditionnelles de culture microbienne sont limités par les faibles rendements de10,11et est conceptualisés comme un État binaire où une bactérie est présente dans le tube digestif ou pas. Haut débit basées sur l’ADN séquençage a révolutionné l’écologie microbienne, permettant la capture de tous les membres de la communauté microbienne. Cependant, séquence lu durée et la qualité restent des obstacles importants à la taxinomie exacte affectation12. En outre, expériences de base haut débit peuvent souffrir d’effets du lot, où les mesures sont touchés par des variables non biologiques ou non scientifique13. Ces dernières années, plusieurs programmes ont été établis afin d’étudier le microbiome humain, notamment le projet américain Gut, le Microbiome humain du projet des États-Unis (US) et le projet MetaHIT United Kingdom (UK). Ces initiatives ont généré de grandes quantités de données qui ne sont pas facilement comparables en raison d’un manque de cohérence dans leurs approches. Une variété de projets internationaux tels que le Consortium International Microbiome humain, le projet de normes de Microbiome humain International et le National Institute of Standards and Technology (NIST) a tenté de répondre à certaines de ces questions14 et mis au point des normes pour les mesures de microbiome qui doivent permettre la réalisation des résultats fiables de reproduction. Décrit ici est un protocole intégré de plusieurs méthodes largement utilisées15,16 pour 16 s rRNA haut débit séquençage (16 s-seq) à partir de prélèvement d’échantillons fécaux à travers des analyses de données. Le protocole décrit une approche sans colonne PCR, initialement conçue pour l’extraction directe d’usine ADN16, permettant le traitement simultané d’un grand nombre de selles dans un temps relativement court avec la qualité des échantillons ADN amplifié ciblée le séquençage de la région variable microbienne de V4 sur une plate-forme commune de séquençage. Ce protocole vise à guider les scientifiques intéressés par lancer l’utilisation de 16 s rRNA-amplicon séquençage de façon robuste, reproduction, facile à utiliser, détaillée, l’utilisation des contrôles importants. Ayant un protocole de guidée et détaillée étape par étape peut minimiser l’effet des lots et permettra ainsi à des résultats de séquençage plus comparables entre les laboratoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
16 s rRNA-amplicon et métagénomique fusil séquençage ont gagné en popularité en microbiologie clinique demandes21,22, 23. Ces techniques sont avantageuses dans leur capacité accrue pour capturer des taxons cultivables et non cultivables, fournissant des données sur l’abondance relative de l’inoculum de pathogène et de leur capacité à identifier plus précisément un polymicrobienne infectieuse empreintes digitales24. Les ava…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le programme I-CORE (subventions no 41/11), l’Israël Science Foundation (subvention no 908/15) et l’European Crohn et Colitis Organisation (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Riferimenti
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