16S rRNA-Amplicon अनुक्रमण द्वारा मल माइक्रोबियल लक्षण वर्णन के लिए निर्देशित प्रोटोकॉल
Summary
इस पांडुलिपि उच्च प्रवाह 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण का एक विस्तृत मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन है । प्रोटोकॉल एक एकीकृत, वर्दीधारी, साध्य, और सस्ती प्रोटोकॉल का परिचय डेटा विश्लेषण के माध्यम से मल नमूना संग्रह से शुरू । इस प्रोटोकॉल कठोर मानकों और कई नियंत्रण के साथ नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।
Abstract
मानव आंत्र microbiome कोशिकाओं की चोट से बचाने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, ऊर्जा और पोषक तत्वों प्रसंस्करण में, और प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने में । क्या एक स्वस्थ microbiota संरचना (dysbiosis) माना जाता है से विचलन महत्वपूर्ण रोग की स्थिति के लिए अग्रणी कार्यों ख़राब कर सकते हैं । हाल ही में और चल रहे अनुसंधान के प्रयास माइक्रोबियल संरचना और मानव स्वास्थ्य और रोग के बीच संघों के लक्षण वर्णन की ओर निर्देशित किया गया है ।
उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में अग्रिम आंत माइक्रोबियल संरचना के लक्षण वर्णन सक्षम करें । इन विधियों में 16S rRNA-amplicon sequencing और शॉटगन अनुक्रमण शामिल हैं । शॉटगन अनुक्रमण जीन भविष्यवाणियों और कार्यात्मक एनोटेशन के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है, जबकि 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण प्रोफ़ाइल taxonomical संरचना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । 16S rRNA जीन चर क्षेत्र के एक लक्षित अनुक्रमण विधि का उपयोग करने में एक फायदा यह शॉटगन अनुक्रमण की तुलना में काफी कम लागत है । अनुक्रम 16S rRNA जीन में अंतर की पहचान करने के लिए एक माइक्रोबियल फिंगरप्रिंट के रूप में इस्तेमाल कर रहे है और एक व्यक्ति के नमूने के भीतर अलग taxa यों ।
प्रमुख अंतरराष्ट्रीय प्रयासों 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के लिए मानकों को सूचीबद्ध किया है । हालांकि, कई अध्ययनों बैच प्रभाव के कारण भिन्नता का एक सामान्य स्रोत रिपोर्ट । इस प्रभाव को कम करने के लिए, नमूना संग्रह, संसाधन और sequencing के लिए वर्दीधारी प्रोटोकॉल कार्यांवित किया जाना चाहिए । यह प्रोटोकॉल मल नमूना संग्रह से डेटा विश्लेषण करने के लिए शुरू मोटे तौर पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के एकीकरण का प्रस्ताव है । इस प्रोटोकॉल एक स्तंभ मुक्त, प्रत्यक्ष-पीसीआर दृष्टिकोण है कि एक साथ हैंडलिंग और मल नमूनों की बड़ी संख्या के डीएनए निष्कर्षण, V4 क्षेत्र की पीसीआर प्रवर्धन के साथ सक्षम बनाता है शामिल हैं । इसके अलावा, प्रोटोकॉल विश्लेषण पाइपलाइन का वर्णन करता है और QIIME (QIIME 2 संस्करण 2017.7.0 और DADA2) के नवीनतम संस्करण का उपयोग कर एक स्क्रिप्ट प्रदान करता है । यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल एक मजबूत, प्रजनन, प्रयोग करने में आसान, विस्तृत तरीका में 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के उपयोग की शुरुआत में रुचि रखने वालों के मार्गदर्शन के उद्देश्य से है ।
Introduction
केंद्रित प्रयासों को बेहतर microbiome विविधता और बहुतायत समझ में किया गया है, अंतर और स्वस्थ और रोग की स्थिति में व्यक्तियों के बीच समानता पर कब्जा करने का एक और पहलू के रूप में । आयु2,3, भूगोल4, जीवन शैली5,6, और बीमारी5 आंत microbiome की संरचना के साथ जुड़े होना दिखाया गया है, लेकिन कई शर्तों और आबादी अभी तक पूरी तरह से नहीं किया गया है विशेषता. हाल ही में यह बताया गया है कि microbiome चिकित्सीय अनुप्रयोगों7,8,9के लिए संशोधित किया जा सकता है । इसलिए, विभिंन शारीरिक स्थितियों और माइक्रोबियल संरचना के बीच संबंधों में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि संभावित भविष्य के संशोधनों के अनुकूलन की ओर पहला कदम है ।
पारंपरिक माइक्रोबियल संस्कृति के तरीकों कम पैदावार10,11द्वारा सीमित हैं, और एक द्विआधारी राज्य जहां एक जीवाणु या नहीं आंत में मौजूद है के रूप में धारणा है । उच्च-प्रवाह डीएनए आधारित अनुक्रमण माइक्रोबियल समुदाय के सभी सदस्यों के कब्जे को सक्षम करने, सूक्ष्म जीवाणु पारिस्थितिकी क्रांति की है । हालांकि, अनुक्रम पढ़ें लंबाई और गुणवत्ता सटीक वर्गीकरण असाइनमेंट12के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं रहते हैं । इसके अलावा, उच्च प्रवाह आधारित प्रयोगों बैच प्रभाव, जहां माप गैर जैविक या गैर वैज्ञानिक चर13से प्रभावित कर रहे हैं से पीड़ित हो सकता है । हाल के वर्षों में, अमेरिकी आंत परियोजना, संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएस) मानव microbiome परियोजना, और यूनाइटेड किंगडम (यूके) MetaHIT परियोजना सहित मानव microbiome का अध्ययन करने के लिए कई कार्यक्रमों की स्थापना की गई है । इन पहलों डेटा है कि आसानी से उनके दृष्टिकोण में निरंतरता की कमी के कारण तुलनीय नहीं कर रहे है की विशाल मात्रा में उत्पंन किया है । अंतरराष्ट्रीय मानव Microbiome कंसोर्टियम, अंतरराष्ट्रीय मानव Microbiome मानक परियोजना, और राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (NIST) के रूप में अंतरराष्ट्रीय परियोजनाओं की एक किस्म इन मुद्दों में से कुछ को संबोधित करने का प्रयास किया14 , और microbiome मापन के लिए विकसित मानक जो विश्वसनीय प्रजनन परिणामों की उपलब्धि को सक्षम करना चाहिए. यहां वर्णित कई मोटे तौर पर इस्तेमाल किया तरीकों की एक एकीकृत प्रोटोकॉल15,16 16S rRNA उच्च प्रवाह अनुक्रमण (16S-seq) डेटा विश्लेषण के माध्यम से मल नमूना संग्रह से शुरू करने के लिए है । प्रोटोकॉल एक कॉलम मुक्त पीसीआर दृष्टिकोण, मूलतः संयंत्र डीएनए के प्रत्यक्ष निष्कर्षण के लिए डिजाइन16का वर्णन, एक अपेक्षाकृत कम समय में मल नमूनों की बड़ी संख्या के एक साथ निपटने के लिए उच्च गुणवत्ता के साथ परिवर्धित डीएनए को सक्षम करने के लिए लक्षित एक आम अनुक्रमण मंच पर माइक्रोबियल चर V4 क्षेत्र के sequencing । इस प्रोटोकॉल के लिए एक मजबूत, प्रजनन, प्रयोग करने में आसान, विस्तृत तरीका, महत्वपूर्ण नियंत्रण का उपयोग करने में 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के उपयोग की शुरुआत में रुचि वैज्ञानिकों गाइड करना है । एक निर्देशित और विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल बैच प्रभाव को कम करने और इस प्रकार प्रयोगशालाओं के बीच और अधिक तुलनीय अनुक्रमण परिणाम की अनुमति देगा कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA-amplicon और metagenomics शॉटगन अनुक्रमण नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान अनुप्रयोगोंके21,22, 23में लोकप्रियता हासिल की है । इन तकनीकों को अपने में वृद्धि culturable और गैर culturable taxa पर कब्जा करने की क्षमता म?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम I-कोर कार्यक्रम (अनुदान सं 41/11), इज़राइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं 908/15), और यूरोपीय Crohn और कोलाइटिस संगठन (ECCO) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Riferimenti
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