16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル
Summary
本稿では、高スループット 16S rRNA 増幅シーケンスの詳細な標準化されたプロトコルについて説明します。プロトコルには、データ分析を通じて糞便サンプル コレクションから統合、制服を着た、実現可能な安価なプロトコルが導入されています。このプロトコルには、厳格な基準とサンプルの多数の分析といくつかのコントロールができます。
Abstract
人間の腸内マイクロバイ損傷から細胞を保護する上で、エネルギーと栄養分の処理に、免疫を促進する上で中心的な役割を果たしています。健全な細菌叢の組成 (dysbiosis) と考えられるものからの逸脱は、病的な状態につながる重要な機能を損なう可能性があります。最近、継続的な研究努力は微生物組成と人間の健康と病気の間の関連付けのキャラクタリゼーション向かっていた。
高スループット シーケンス技術の進歩は、腸内細菌の組成の特性を有効にします。16S rRNA 増幅配列には散弾銃の配列が含まれます。16S rRNA 増幅シーケンスを使用して、ショットガン ・ シークエンシング法遺伝子の予言と機能アノテーションに関する追加情報を提供しますが、分類学的組成をプロファイルします。16S rRNA 遺伝子の可変領域のターゲット シーケンスのメソッドを使用しての利点は、ショットガン ・ シークエンシング法と比較して大幅に低コストです。16S rRNA 遺伝子配列の差異は、異なる分類群の個々 のサンプル内の定量化微生物指紋として使用されます。
主要な国際的な取り組みは 16S rRNA 増幅配列のための標準を入隊しています。ただし、いくつかの研究は、バッチの効果によって引き起こされる変化の一般的な原因を報告します。サンプル コレクションの制服を着たプロトコルは、この効果を最小限に抑えるため、処理、およびシーケンスを実装する必要があります。このプロトコルは、糞便のサンプル コレクションからデータ解析に広く使用されているプロトコルの統合を提案します。このプロトコルには、同時処理および V4 領域の PCR の拡大と共に、糞便の多数の DNA 抽出できるよう、柱のないダイレクト PCR アプローチが含まれています。さらに、プロトコル解析パイプラインをについて説明し、QIIME (QIIME 2 バージョン 2017.7.0 と DADA2) の最新バージョンを使用してスクリプトを提供します。このステップバイ ステップのプロトコルは、堅牢な生殖、使いやすい、詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味のある方をガイドする対象です。
Introduction
力を注いではマイクロバイ多様性と違いと健康および病理学的条件における個体間の類似点をキャプチャの別の側面としての豊かさを理解するためになされました。年齢2,3、地理学4、ライフ スタイル5,6、および病気5腸内細菌の叢の組成に関連付けられていることが示されたが、多くの条件や人口がまだ完全特徴とします。最近、治療への応用7,8,9マイクロバイを変更できることが報告されています。したがって、いろいろな生理的条件と微生物の組成の関係に追加の洞察力は、潜在的な将来の変更の最適化への第一歩です。
伝統的な微生物培養法低利回り10,11, に制限は、細菌がいずれかのバイナリの状態として概念化、腸内に存在しない、または。ハイスループット DNA ベースのシーケンスは、微生物生態学、微生物のコミュニティのすべてのメンバーのキャプチャを有効にするをもたらしました。ただし、シーケンスは、長さと質に残る正確な分類割り当て12への重要な障壁を読み取る。さらに、高スループットに基づいて実験の測定は非生物学的または非科学的な変数13によって影響を受ける、バッチの効果に苦しむことがあります。近年、アメリカの腸プロジェクト、アメリカ合衆国 (米国) 人間マイクロバイ プロジェクト、およびイギリス (英国) の MetaHIT プロジェクトを含む人間のマイクロバイを勉強するいくつかのプログラムを設けています。これらの取り組みは、彼らのアプローチに一貫性の欠如のため容易に対等ではないデータの膨大な量を生成しています。さまざまな国際人間マイクロバイ コンソーシアム、国際人間マイクロバイ基準プロジェクトと米国商務省標準技術局 (NIST) などの国際プロジェクト14 これらの問題の一部に対処しようとしています。、信頼性の高い生殖の結果の達成を可能にする必要がありますマイクロバイ測定のための基準を開発しました。ここで説明は 16S rRNA 高スループット シーケンス (seq 16S) 開始データ分析を通じて糞便サンプルのコレクションからのいくつかの広く使用されている方法15,16の統合されたプロトコルです。プロトコル記述列無料 PCR アプローチ、植物 DNA16の直接抽出用に設計された、高品質で比較的短時間でサンプル増幅 DNA 糞便の多数の同時処理を有効にする対象のシーケンスの共通プラットホームを微生物可変 V4 領域のシーケンス。このプロトコルは、堅牢な生殖、使いやすい、詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味がある重要なコントロールを使用して科学者のガイドを目指しています。ガイドと詳細なステップバイ ステップ プロトコルを持つバッチ効果を最小限に抑えることができるし、ラボ間比較可能なシーケンス結果がこのようになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA 増幅とメタゲノム ショットガン ・ シークエンシング法は、臨床微生物学アプリケーション21,-2223で人気を得ています。これらのテクニック、人為的・非人為的分類群、病原性菌の能力をより正確にモデルの感染を識別するために相対的な豊かさについてのデータを提供することをキャプチャする能力を向上に有利であります。指紋の<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、(許可番号 41/11) – コア ・ プログラム、大腸炎の組織 (ECCO) とイスラエル科学財団 (グラント第 908/15) ヨーロッパのクローンの部分で支えられました。
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Riferimenti
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