Руководствуясь протокол для фекальных микробиологических характеристик путем Sequencing 16S рРНК ампликонами
Summary
Эта рукопись описывает подробный стандартизированный протокол высок объём 16S рРНК ампликонами последовательности. Протокол вводит комплексной, униформе, осуществимым и недорогой протокол, начиная от фекальных проб путем анализа данных. Этот протокол позволяет анализ большого числа проб с жестким стандартам и несколько элементов управления.
Abstract
Человека кишечная микрофлора играет центральную роль в защите клеток от повреждения, в обработке энергии и питательных веществ и в содействии иммунитета. Отклонения от того, что считается здоровой микробиоты композиция (дисбактериоз) могут ухудшить жизненно важных функций, приводит к патологическим условий. Недавние и текущие исследовательские усилия были направлены на квалификацию ассоциаций между микробный состав и здоровье человека и болезни.
Достижения в технологии высокопроизводительного секвенирования позволяют характеристика микробный состав кишки. Эти методы включают в себя 16S рРНК ампликонами последовательность и последовательность ружье. 16S рРНК ампликонами последовательности используется для профилирования Таксономический состав, в то время как дробовик виртуализации предоставляет дополнительные сведения о Джин предсказания и функциональной заметки. Преимущество в использовании целевых последовательности метода переменной региона гена 16S рРНК является его значительно более низкой стоимости, по сравнению с ружьем последовательности. Различия последовательности гена 16S рРНК используются как микробных отпечатков пальцев для идентификации и количественной оценки различных таксонов в индивидуальный образец.
Крупные международные усилия привлекаются стандартов для 16S рРНК ампликонами последовательности. Однако несколько исследований сообщают общий источник изменения, вызванные пакетного эффектом. Чтобы свести к минимуму этот эффект, силовых протоколы для сбора, обработки и последовательности должен быть реализован. Этот протокол предлагает интеграцию широко используемых протоколов, начиная от фекальных проб для анализа данных. Этот протокол включает в себя столбец бесплатно, прямой ПЦР подход, который позволяет одновременной обработки и экстракции ДНК большого количества фекальных проб, наряду с амплификации PCR V4 региона. Кроме того протокол описывает анализ конвейера и предоставляет сценарий, используя последнюю версию QIIME (QIIME 2 версия 2017.7.0 и DADA2). Этот шаг за шагом протокол предназначен для тех, кто заинтересован в инициировании использование 16S рРНК ампликонами последовательности в устойчивый, репродуктивной, простой в использовании, подробное руководство.
Introduction
Концентрированные усилия лучше понять разнообразие микрофлора и изобилия, как еще один аспект захвата различия и сходства между людьми в условиях здоровой и патологические. Возраст2,3, география4, образ жизни5,6, болезни5 были продемонстрированы и ассоциироваться с составом микрофлора кишечника, но многие условия и население еще не были полностью характеризуется. Недавно сообщалось, что микрофлора может быть изменено для терапевтического применения7,8,9. Таким образом дополнительные понять связь между различными физиологическими условиями и микробный состав является первым шагом на пути оптимизации потенциальных будущих изменений.
Методы традиционной микробные культуры ограничены низкой урожайности на10,11и задумана как двоичные государства, где бактерии либо представить в кишечнике или нет. Высокой пропускной способностью на основе ДНК последовательности революционизировало микробной экологии, позволяя захват всех членов сообщества микроорганизмов. Однако последовательности чтения длины и качества сохраняются значительные барьеры для точной таксономии назначения12. Кроме того высокой пропускной способностью на основе экспериментов могут страдать от последствий партии, где измерения подвержены переменных небиологических или научно-13. В последние годы были созданы несколько программ для изучения человеческого микрофлора, включая американский кишки проекта, проект человека микрофлора Соединенные Штаты (США) и Соединенное Королевство (Великобритания) MetaHIT проект. Эти инициативы породили огромное количество данных, которые не являются легко сопоставимы ввиду отсутствия согласованности в их подходах. Целый ряд международных проектов, таких как международного консорциума по микрофлора человека, стандарты микрофлора человека международного проекта и Национальный институт стандартов и технологий США (NIST) пытался решить некоторые из этих вопросов14 и разработал стандарты для измерения микрофлора, которые должны позволить достижение надежного репродуктивного результатов. Описанные здесь — это интегрированный протокол несколько широко используются методы,1516 для 16S рРНК высокопроизводительного секвенирования (16S-seq) начиная от фекальных проб через анализ данных. Протокол описывает столбец бесплатно ПЦР подход, первоначально предназначенные для прямого извлечения завода ДНК16, возможность одновременной обработки большого количества фекальных проб в относительно короткие сроки с высоким качеством усиленный ДНК для целевых секвенирование микробной переменной региона V4 на общей платформе виртуализации. Этот протокол направлен на руководство ученых, заинтересованных в инициировании использование 16S рРНК ампликонами последовательности образом надежные, репродуктивной, простой в использовании, подробную, используя важных элементов управления. С гидом и подробно шаг за шагом протокол может свести к минимуму эффект партии и таким образом позволит более сопоставимые результаты секвенирования между лабораториями.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S рРНК ампликонами и метагеномики ружье последовательности завоевали популярность в клинической микробиологии приложения21,22,23. Эти методы являются выгодным в их повышенная способность захватить culturable и не culturable таксонов, предоставление данных о относ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали программу-CORE (гранты № 41/11), Израиль научный фонд (Грант № 908/15) и Европейской крона и колит Организации (ЕСОП).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Riferimenti
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
