바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처
Summary
여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.
Abstract
바이오-레이어 간섭계 (BLI) 분석 결과 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용을 측정 하기 위한 유용한 도구입니다. 여기, 우리가 먼저 인간 EAG1의 상호 작용을 공부 하이 소설 레이블 없는 기술의 응용 프로그램 설명 (hEAG1) 채널 단백질 작은 분자 핍2. hEAG1 채널 암 및 신경 질환의 어떤 종류에 관련 된 몇 가지 이득의 기능 돌연변이 탈 선 overexpression 때문에 잠재적인 치료 표적으로 인식 하고있다. 우리는 포유류 안정적인 식 시스템에서 hEAG1 채널 단백질을 순화 하 고 씨에 의해 핍2 와 상호 작용을 측정. HEAG1 단백질 및 PIP2 간의 바인딩의 활동의 성공 측정 씨 분석 결과 이온 채널 약리학에 소설 작은 분자 ligand 심사에 사용 되는 잠재적인 높은 처리량 접근 방식을 보여 줍니다.
Introduction
타겟팅 작은 분자와 세포 표면 수 이온 채널 단백질 ligand 심사 및 생물 학적 약물 발견1,2,3에 대 한 엄청난 잠재력을 제공 합니다. 따라서, 적절 한 도구 이온 채널 및 작은 분자와 그들의 해당 기능 간의 상호 작용을 공부 하 고 필요 합니다. 패치 클램프 기록 이온 채널의 기능 분석 결과에 독특하고 대신할 기술 될 입증 되었습니다. 그러나, 다른 기술을 요구 작은 분자 이온 채널을 직접 대상 여부 결정. 전통적으로, 방사성 ligand 바인딩 분석 결과 바인딩 사이의 작은 분자 및 그 대상 이온 채널 단백질의 활동을 관찰 하기 위해 사용 되었다. 그러나,이 기술의 사용 제한 됩니다 자사의 요구 사항으로 인해 방사성 라벨 및 탐지에. 또한, 연구에 작은 ligand를 필수 단계 알려진된 특정 ligand 없이 이온 채널의 많은 종류에서는 사용 하 여 방지할 수 있습니다. 일부 레이블 없는 기법 NMR 분광학, 엑스레이 회절, 미 thermophoresis (MST)4 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 등 단백질 작은 분자 상호 작용을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 하지만 이러한 유형의 분석 실험 일반적으로 전체 길이 단백질, 역학, 낮은 처리량 및 높은 비용5의 낮은 해상도 얻을 하는 데 어려움 때문에 충분 한 정보를 제공할 수 없습니다. 이러한 기술을 달리 바이오-레이어 간섭계 (BLI)의 표면에 단백질 샘플의 작은 금액을 immobilizing 여 단백질 작은 분자 상호 작용 검출을 위한 이러한 단점을 극복 하기 위해 새로운 레이블 없는 방법론으로 나오고 있다 바이오 센서와 광학 변경 측정 신호6,7. 유망한 바이오 센서 플랫폼으로 라스 기술은 이미 인간 단일 클론 항 체 CR80208 등 수용 성 단백질 자연 물으로 작은 분자의 상호 작용을 관찰 하 수행 되 고 상세한 분석 결과 절차에 보고 되었습니다는 이전 기사9. 새로운 치료 목표 발견을 위한 이온 채널 단백질의 중요 한 역할을 인정 하지만 이온 채널 단백질 작은 분자 상호 작용 분석 결과 라스에 기반 하지 설명 하고있다.
인간 에테르 일품- 채널 (hEAG1) 다양 한 종류의 암 세포와는 채널 a 잠재적인 치료 타겟이 많은 암과 신경 장애10,11의 중앙 신경 조직 표현 12,,1314. 우리 실험실에서 electrophysiological 연구 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2) hEAG1 채널15의 억제 효과 확인 했습니다. 직접 씨 기술을 사용 하 여 hEAG1와의 상호 작용 특히 특정 ligands를 부족 그 채널에 대 한 이온 채널 단백질 작은 분자 화합물 상호 작용의 다른 유형에 대 한 모델 수 핍2 테스트, 우리의 결과에 따라. 씨 분석 결과의 지침에 따라 우리는 hEAG1 단백질 biotinylated를 준비 하 고 그들을 움직일 streptavidin (SA)의 표면에 바이오 센서 팁 다음 상호 작용 그들 핍2 솔루션 사이의 직접 바인딩을 관찰 하는 단백질 그리고 지질은. 핍2 의 첨부 hEAG1 단백질 코팅된 표면, 표면에 층의 두께를 증가, 후는 직접 스펙트럼 변화를 연결 하 고 실시간16에서 측정 될 수 있다. 바인딩 활동 협회 단계에서 긍정적인 변화 및 부정적인 변화 분리 단계에서 확인할 수 있습니다. 이 원리에 따르면 우리는 HEK 239T 안정 식 시스템에서 기능 hEAG1 이온 채널 단백질을 정화 하는 상태를 유지 하는 생체 외에서 기능, 친 화력 정화 방법을 사용 하 여 다음의 바인딩의 활동을 측정 다른 농도2, 핍 고 electrophysiological 측정15에 관측 된 semblable 운동 데이터를 굴복. 씨에서 결과 및 electrophysiological 측정 사이 가까운 통신 처음으로 이온 채널 막 단백질 작은 분자 상호 작용에 대 한 적절 한 분석 도구로 서 씨의 적합성을 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
막 이온 채널의 다양 한 심장 혈관 및 신경 질환18를 포함 하 여 인간의 질병 치료에 대 한 현재 알려진된 약물의 13%의 주 치료 대상으로 확인 되었습니다. 패치 클램프 기록, 작은 분자와 이온 채널의 기능을 측정 하기 위한 황금 표준 널리 사용 되었습니다 이온 채널 ligands 심사에 대 한. 그러나, 이러한 electrophysiological 접근 수 없습니다 입증 여부 작은 분자 바인딩합니다 직접 채…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 바이오 ID 센터 및 의학 및 공학 (YG2016QN66), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31271217), 및 국가 기본 연구 프로그램의 중국 (2014CB910304)에서 SJTU 크로스-징계 연구 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
Riferimenti
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