القياس الكمي المطلق من مستويات البلازما MicroRNA في القرود سينومولوغوس، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR
Summary
ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لقياس المستويات المطلقة لميرنا البلازما، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR مع أو بدون تضخيم ما قبل. هذا البروتوكول يتيح فهم أفضل لكمية ميرناس البلازما ويسمح التقييم النوعي للبيانات المناظرة من دراسات مختلفة أو المختبرات.
Abstract
RT-قبكر واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لتقييم ميرناس الهدف الفردي. يتم قياس مستويات ميرناس عموما بالنسبة إلى عينة مرجعية. وهذا النهج مناسبة لدراسة التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، الكمي المطلق أفضل من التحليل الإحصائي باستخدام الأفضل لإجراء تقييم شامل لمستويات التعبير الجيني. القياس الكمي المطلق هو ما زالت لا في الاستعمال الشائع. ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لقياس المستويات المطلقة لميرنا البلازما، استخدام الرايت قبكر مع أو بدون ما قبل التضخيم.
أعدت وحدة تخزين ثابتة (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من هذا السياق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50). تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع تستخدم نظام متاح تجارياً. تم قياس كمية ميرناس البلازما بفحوصات قبكر RT المستندة إلى التحقيق الذي يتضمن ميرنا على حدة إلى الأمام/عكس PCR التمهيدي والتحقيق. المنحنيات القياسية للقياس الكمي المطلق تم إنشاؤها باستخدام النوكليوتيد الحمض النووي الريبي الاصطناعية المتاحة تجارياً. اصطناعية cel-مير-238 كعنصر تحكم خارجي لتقييم جودة والتطبيع. ميرناس أن أظهر تقدير القيم دورة (Cq) أعلاه 35 تم تضخيم مسبقاً قبل الخطوة qPCR.
بين ميرناس 8 التي درست، مير-122 و 133a مير مير-192 كانت قابلة للكشف دون ما قبل التضخيم، حين مير-1، مير-206، ومير-499a المطلوبة قبل التضخيم بسبب مستويات منخفضة من التعبير. مير-208a ومير-208b لا يمكن كشفها حتى بعد ما قبل التضخيم. وجرى تقييم كفاءة تجهيز العينة بقيم Cq ارتفعت cel-مير-238. في هذا الأسلوب المقايسة، والتغير التقني قدرت بأقل من 3-fold والحد الأدنى للقياس الكمي (للوق) نسخة2 10/ميليلتر، بالنسبة لمعظم من ميرناس النظر.
هذا البروتوكول يوفر تقدير أفضل لكمية ميرناس البلازما، ويسمح لتقييم نوعية البيانات المناظرة من دراسات مختلفة. وأعرب عن النظر في انخفاض عدد ميرناس في سوائل الجسم، قبل التضخيم مفيد لتعزيز الكشف عن سوء ميرناس.
Introduction
تم استكشاف ميكرورناس (ميرناس) كالمؤشرات الحيوية للتشخيص والتشخيص لأمراض السرطان، عدد متزايد من الدراسات أو الرصد والكشف عن الأمراض الأخرى في الدراسات السريرية و nonclinical1،2،3 . الكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بكر (RT-qPCR) إحدى الطرق الأكثر شيوعاً المستخدمة لتقييم ميرناس الهدف الفردي، لأن هذا الأسلوب أكثر حساسية من ميكرواري4 وتسلسل الحمض النووي الريبي القائمة على منصات5. بشكل عام، يتم قياس التعبير ميرنا مقارنة بعينه مرجعية باستخدام أسلوب ΔCq6. وهذا النهج مناسبة للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، محدودة الكمي النسبي لتعميم ميرناس الأداة المساعدة بسبب تلك الكميات الصغيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختلاف التقني يجعل من الصعب مقارنة النتائج من الدراسات المختلفة، لأن تخصيص مختبرات مختلفة البروتوكولات التجريبية RT-قبكر بطريقة مختلفة، الأمر الذي يؤدي إلى غير متناسقة أو نتائج متناقضة حتى من 7من دراسات مختلفة.
وفي ضوء الشواغل المذكورة أعلاه، قد يكون القياس الكمي المطلق أكثر مناسبة لتقييم كميات صغيرة من ميرناس في سوائل الجسم. يستخدم الأسلوب الكمي المطلق منحنى المعياري المتولدة من تركيزات معروفة من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية متطابقة في تسلسل إلى المقابلة ميرنا الهدف8. الصحة، ومعهد العلوم البيئية (هيسي) اللجنة التقنية المعنية بعلم الجينوم أجرت مؤخرا دراسات شاملة لمقارنة نتائج القياسات المطلقة للبلازما ميرناس، عبر مواقع اختبار متعددة. وأظهرت النتائج أن استخدام بروتوكول قياسي للمطلقة كوانتيتيشن من ميرناس إلى نتائج قابلة للمقارنة عبر مواقع اختبار متعددة9. RT-qPCR المقايسة الطريقة الموضحة في هذه الدراسة مطابق تقريبا لبروتوكول قياسي هيسي، الذي يتضمن تحليل متعدد لميرنا أهداف متعددة، والتضخيم السابقة للمساعدة في الكشف عن ميرناس التعبير منخفضة.
في هذه الدراسة، حجم ثابت (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من المنطلق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50) كانت تستخدم10. البروتوكول التالي يصف الإجراءات لإعداد عينات البلازما، واستخراج ميرنا، و RT-قبكر، بما في ذلك ما قبل التضخيم. الأهم من ذلك، معلومات تقنية إضافية حول البروتوكول قد أدرج، حيث أنه يمكن أن يتم التحقق من صحة كمية ميرناس المستهدفة في العينات في تركيبة مع عملية المؤهلين تأهيلاً جيدا. أولاً، تم التحقق من صحة المنحنى المعياري لكل ميرنا لنطاق الكشف الفردية، قبل القياس الكمي في العينات البيولوجية. ثانيا، تم تقييم جودة المنهجية الحالية صورة شاملة عن طريق الاستبيان المفاهيمي قيم عنصر تحكم خارجي (cel-مير-238). ولذلك، هذا المنبر غلة أكثر من بيانات موثوق بها ومفيدة لمقارنة النتائج من دراسات مختلفة أو المختبرات.
لمحات ميرناس 8 قد أدرجت في هذا التقرير كنتائج تمثيلية من أسلوب الفحص الموضحة هنا. وقد اقترحت هذه ميرناس كما المحتملة سلامة المؤشرات الحيوية المرتبطة بإصابة الأنسجة إلى الكبد (مير-122 ومير-192)، القلب (مير-1 ومير-208a، مير-208b ومير-499a)، والهيكل العظمى والعضلات (133a مير ومير-206) في القوارض والبشر3، 11،،من1213.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدينا تقييم شامل قدم تحليلاً إحصائيا أكثر صرامة على مدى النطاق الديناميكي، الذي يبين بوضوح أن حجم الاختلاف بين العينات الفردية كانت مختلفة للغاية بين ميرناس اختبار. على الرغم من أن هذه الاختلافات يمكن أن يعزى إلى تلك الكميات الصغيرة في سوائل الجسم، تجدر الإشارة إلى أن هذه البيانات تعكس ا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث لم يتلق أي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة، التجاري، أو عدم الربح.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
Riferimenti
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
