כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי
Summary
הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.
Abstract
RT-qPCR היא אחת השיטות הנפוצות להערכת miRNAs היעד בודדים. רמות MiRNAs בדרך כלל נמדדים ביחס דגימת. גישה זו מתאימה לבחינת שינויים פיסיולוגיים רמות הביטוי של גנים היעד. עם זאת, כימות מוחלט באמצעות ניתוח סטטיסטי יותר עדיפה עבור הערכה מקיפה של רמות ביטוי גנים. כימות המוחלט הוא עדיין לא במשותף להשתמש. הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות RT-qPCR עם או בלי הגברה מראש.
נפח קבוע (200 µL) של EDTA-פלזמה הוכן מהדם שנאסף וריד הירך cynomolgus בהכרה קופים (n = 50). סה כ RNA שהופק באמצעות מערכת זמינים מסחרית. פלזמה miRNAs היו לכמת על ידי המבוסס על בדיקה RT-qPCR מבחני אשר מכיל miRNA ספציפי לפנים/הפוכה PCR פריימר בדיקה. עקומות רגיל על כימות מוחלטת נוצרו תוך שימוש זמינים מסחרית oligonucleotides RNA סינתטי. סינתטי צ’ל-מיר-238 שימש פקד חיצוני להערכה נורמליזציה ואיכות. MiRNAs הראה כימות מחזור (סי) ערכים מעל 35 היו מראש מוגבר לפני השלב qPCR.
בין 8 miRNAs בחן, מיר-122, מיר-133a ומיר-192 היו לזיהוי ללא הגברה מראש, ואילו מיר-1, מיר-206 ו miR-499a הנדרש הגברה מראש בגלל רמות נמוכות הביטוי שלהם. MiR-208a מיר-208b היו לא לזיהוי גם לאחר הגברה מראש. הדגימה יעילות העיבוד הוערך על ידי ערכי סי מחודדים צ’ל-מיר-238. בשיטה זו assay, וריאציה טכני היה מוערך להיות פחות 3-fold, הגבול התחתון של כימות (LLOQ) היה העתק2 10/µL, עבור רוב miRNAs בחן.
פרוטוקול זה מספקת אומדן טוב יותר כמות פלזמה miRNAs, ומאפשרת הערכת איכות הנתונים המתאימים ממחקרים שונים. בהתחשב שהמספר הנמוך של miRNAs בנוזלי גוף, קדם הגברה שימושית לשפר זיהוי של גרוע הביע miRNAs.
Introduction
מספר גדל והולך של מחקרים יש כבר חקר מיקרו Rna (miRNAs) כמו סמנים ביולוגיים עבור האבחון, הפרוגנוזה של סרטן, או ניטור וכן זיהוי מחלות אחרות מחקרים קליניים nonclinical1,2,3 . כמותיים שעתוק במהופך בזמן אמת PCR (RT-qPCR) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשימוש לצורך הערכת miRNAs היעד בודדים, כי טכניקה זו הוא יותר רגיש ממה microarray4 ו- RNA רצף המבוסס על פלטפורמות5. באופן כללי, miRNA ביטוי נמדד ביחס דוגמה הפניה באמצעות שיטת ΔCq6. גישה זו מתאימה עבור חוקרים שינויים פיסיולוגיים רמות הביטוי של גנים היעד. עם זאת, כימות היחסי של מחזורי miRNAs מוגבל השירות בגלל כמויות קטנות שלהם. בנוסף, וריאציה טכני עושה את זה קשה להשוות את התוצאות ממחקרים שונים, כי מעבדות שונות להתאים הפרוטוקולים ניסיוני RT-qPCR אחרת, מה שמוביל לא עקבי או אפילו סותרות נובעת מחקרים שונים7.
על רקע חששות שהוזכרו לעיל, כימות מוחלט עשוי להיות מתאים יותר ההערכה כמויות קטנות של miRNAs בנוזלי גוף. השיטה כימות המוחלטת משתמש עיקול רגיל המופקים ידוע ריכוזי oligonucleotides RNA סינתטי זהים ברצף המתאים למטרה miRNA8. בריאותם של המכון למדעי הסביבה (HESI) הוועדה הטכנית גנומיקה שנערך לאחרונה מחקרים מקיפים כדי להשוות את התוצאות של המידות המוחלט של פלזמה miRNAs, באתרים מרובים של הבדיקה. התוצאות הראו כי באמצעות פרוטוקול תקשורת עבור כימות מוחלטת של miRNAs הניבו תוצאות דומות על פני אתרי מבחן מספר9. RT-qPCR assay השיטה המתוארת במחקר הנוכחי הוא כמעט זהה לזה של HESI ההליך הרגיל, הכולל ניתוח מרובבת של miRNA מטרות מרובות, ושל הגברה מראש כדי לסייע זיהוי miRNAs ביטוי נמוך.
במחקר זה, נפח קבוע (200 µL) של EDTA-פלזמה מוכן מהדם שנאסף וריד הירך cynomolgus בהכרה קופים (n = 50) היה בשימוש10. הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך עבור הכנת דגימות פלסמה, החילוץ של miRNA, ו- RT-qPCR, כולל הגברה מראש. חשוב מכך, פרטים טכניים נוספים אודות הפרוטוקול כבר כלול, כך כמות היעד miRNAs הדגימות הניתנים לאימות בשילוב עם תהליך מוסמך מאוד. ראשית, העקומה סטנדרטי של כל miRNA אומתה עבור טווח זיהוי הפרט שלו, לפני שלה כימות בדגימות ביולוגיות. שנית, האיכות של המתודולוגיה הנוכחית באופן מקיף הוערך על-ידי סי ערכים של פקד חיצוני (cel-מיר-238). לכן, פלטפורמה זו מניבה נתונים מקיף ואמין יותר לצורך השוואת תוצאות של מחקרים שונים או מעבדות.
הפרופילים של 8 miRNAs נכללו בדו ח זה כתוצאות נציג מן השיטה assay המתוארים כאן. אלה miRNAs הוצעו כפי פוטנציאליים בטיחות סמנים ביולוגיים הקשורים עם פציעה של רקמות הכבד (122-מיר ומיר-192), הלב (מיר-1, מיר-208a, מיר-208b ומיר-499a), ואת שרירי השלד (מיר-133a ומיר-206) מכרסמים ובני אדם3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
להערכתנו, מקיף מספק ניתוח סטטיסטי קפדנית יותר של היקף הטווח הדינמי, אשר לציין בבירור סדר הגודל של וריאציה בין דוגמאות בודדות היה שונה מאוד בין miRNAs נבדק. למרות לווריאציות אלה ניתן לייחס שלהם כמויות קטנות של נוזלי הגוף, יצוין כי נתונים אלו משקפים לא רק הווריאציות ביולוגי, אלא גם וריאציות טכנ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר הזה לא קיבל כל מענק ספציפי מהארגונים במגזר הציבורי, מסחריים, או שלא למטרות רווח.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
Riferimenti
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
