Cynomolgus बंदरों में प्लाज्मा MicroRNA स्तर के निरपेक्ष ठहराव, मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर का उपयोग
Summary
इस रिपोर्ट में प्लाज्मा miRNA के निरपेक्ष स्तर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर के साथ या बिना पूर्व प्रवर्धन का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल प्लाज्मा miRNAs की मात्रा की बेहतर समझ affords और विभिंन अध्ययनों या प्रयोगशालाओं से इसी डेटा के गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है ।
Abstract
RT-qPCR व्यक्तिगत लक्ष्य miRNAs का आकलन करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है. MiRNAs स्तर आम तौर पर एक संदर्भ नमूने के सापेक्ष मापा जाता है । यह दृष्टिकोण लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के स्तर में शारीरिक परिवर्तन की जांच के लिए उपयुक्त है । हालांकि, निरपेक्ष ठहराव बेहतर सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के स्तर के एक व्यापक आकलन के लिए अच्छा है । निरपेक्ष ठहराव अभी भी आम उपयोग में नहीं है । इस रिपोर्ट के साथ या पूर्व प्रवर्धन के बिना RT-qPCR का उपयोग कर, प्लाज्मा miRNA के निरपेक्ष स्तर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
EDTA-प्लाज्मा के एक निश्चित मात्रा (२०० µ एल) सचेत cynomolgus बंदरों की ऊरु नस (n = ५०) से एकत्र रक्त से तैयार किया गया था । कुल आरएनए वाणिज्यिक उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर निकाला गया था. प्लाज्मा miRNAs जांच-आधारित आरटी-qPCR परख जो miRNA-विशिष्ट फॉरवर्ड/रिवर्स पीसीआर प्राइमर और जांच द्वारा quantified थे । मानक curves निरपेक्ष ठहराव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides का उपयोग कर उत्पंन किया गया । एक सिंथेटिक cel-मीर-२३८ सामान्यीकरण और गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक बाहरी नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. miRNAs कि ठहराव चक्र (सीक्यू) ३५ ऊपर मूल्यों दिखाया पहले qPCR कदम से पहले परिवर्धित थे ।
इनमें से 8 miRNAs की जांच की, मीर-१२२, मीर-133a, और मीर-१९२ पूर्व प्रवर्धन के बिना detectable थे, जबकि मीर-1, मीर-२०६, और मीर-499a की आवश्यकता पूर्व उनके कम अभिव्यक्ति के स्तर के प्रवर्धन । पूर्व-प्रवर्धन के बाद भी मीर-208a और मीर-208 बी का पता नहीं लगा. नमूना प्रसंस्करण दक्षता नुकीला cel-मीर-२३८ के सीक्यू मूल्यों द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इस परख विधि में, तकनीकी भिन्नता से कम 3 गुना होने का अनुमान था और ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा थी 102 कॉपी/µ l, अधिकांश के लिए जांच की miRNAs.
इस प्रोटोकॉल प्लाज्मा miRNAs की मात्रा का एक बेहतर अनुमान प्रदान करता है, और विभिंन अध्ययनों से इसी डेटा के गुणवत्ता मूल्यांकन की अनुमति देता है । शरीर के तरल पदार्थ में miRNAs की कम संख्या को ध्यान में रखते हुए, पूर्व प्रवर्धन खराब व्यक्त miRNAs का पता लगाने को बढ़ाने के लिए उपयोगी है ।
Introduction
अध्ययन की बढ़ती संख्या निदान और कैंसर का निदान, या निगरानी और नैदानिक और नैदानिक अध्ययन में अन्य बीमारियों का पता लगाने के लिए के रूप में microRNAs (miRNAs) की खोज कर रहा है1,2,3 . मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (RT-qPCR) सबसे आम तरीकों में से एक है व्यक्तिगत लक्ष्य miRNAs का आकलन करते थे, क्योंकि इस तकनीक microarray4 और आरएनए अनुक्रमण आधारित प्लेटफार्मों5से अधिक संवेदनशील है । सामांय में, miRNA व्यंजक ΔCq विधि6का उपयोग करते हुए संदर्भ नमूने के सापेक्ष मापा जाता है । यह दृष्टिकोण लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति स्तर में शारीरिक परिवर्तन की जांच के लिए उपयुक्त है । हालांकि, परिचालित miRNAs के सापेक्ष ठहराव उनकी छोटी मात्रा के कारण सीमित उपयोगिता है । इसके अतिरिक्त, तकनीकी भिन्नता से विभिन्न अध्ययनों से परिणामों की तुलना करना कठिन हो जाता है, क्योंकि विभिन्न प्रयोगशालाओं ने आरटी-qPCR प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को अलग तरह से अनुकूलित कर देते हैं, जो असंगत या यहां तक कि विरोधाभासी परिणामों की ओर जाता है अलग पढ़ाई7.
उपर्युक्त चिंताओं को ध्यान में रखते हुए, निरपेक्ष ठहराव शरीर के तरल पदार्थ में miRNAs की छोटी मात्रा के आकलन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है । निरपेक्ष ठहराव विधि सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides के ज्ञात सांद्रता से उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग करता है जो इसी लक्ष्य miRNA8के अनुक्रम में समरूप होते हैं । स्वास्थ्य और पर्यावरण विज्ञान संस्थान (HESI) जीनोमिक्स पर तकनीकी समिति ने हाल ही में व्यापक अध्ययन का आयोजन किया प्लाज्मा miRNAs के पूर्ण मापन के परिणामों की तुलना, कई परीक्षण साइटों के पार । परिणाम से पता चला कि miRNAs के निरपेक्ष quantitation के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग एकाधिक परीक्षण साइटों9भर में तुलनीय परिणाम प्राप्त किया. RT-qPCR परख वर्तमान अध्ययन में वर्णित विधि लगभग HESI के मानक प्रोटोकॉल है, जो कई miRNA लक्ष्य के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण भी शामिल है, और पूर्व प्रवर्धन के लिए कम अभिव्यक्ति miRNAs का पता लगाने सहायता के समान है ।
इस अध्ययन में जागरूक cynomolgus बंदरों की ऊरु नस (n = ५०) से एकत्र रक्त से तैयार EDTA-प्लाज्मा की एक निश्चित मात्रा (२०० µ l) को10प्रयोग किया गया । निंनलिखित प्रोटोकॉल प्लाज्मा नमूनों की तैयारी के लिए प्रक्रिया का वर्णन, miRNA के निष्कर्षण, और आरटी-qPCR, पूर्व वर्धन सहित । इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल के बारे में अतिरिक्त तकनीकी जानकारी शामिल किया गया है, ताकि नमूनों में लक्ष्य miRNAs की मात्रा एक अच्छी तरह से योग्य प्रक्रिया के साथ संयोजन में मान्य किया जा सकता है. सबसे पहले, प्रत्येक miRNA के मानक वक्र अपने व्यक्तिगत पहचान रेंज, जैविक नमूनों में इसके ठहराव से पहले के लिए मांय किया गया था । दूसरा, वर्तमान पद्धति की गुणवत्ता व्यापक एक बाहरी नियंत्रण के सीक्यू मूल्यों के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था (cel-मीर-२३८) । इसलिए, इस मंच पैदावार विभिंन अध्ययनों या प्रयोगशालाओं से परिणाम की तुलना के लिए और अधिक जानकारीपूर्ण और विश्वसनीय डेटा ।
8 miRNAs की प्रोफाइल परख विधि से प्रतिनिधि परिणाम के रूप में इस रिपोर्ट में शामिल किया गया है यहां वर्णित है । इन miRNAs को जिगर (मीर-१२२ और मीर-१९२) को ऊतक की चोट से जुड़े संभावित सुरक्षा वाले मार्क्स के रूप में प्रस्तावित किया गया है, दिल (मीर-1, मीर-208a, मीर-208 बी, और मीर-499a), और कंकाल की मांसपेशी (मीर-133a और मीर-२०६) कुतर और मनुष्यों में 3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे व्यापक मूल्यांकन गतिशील रेंज है, जो स्पष्ट रूप से संकेत दिया है कि व्यक्तिगत नमूनों के बीच भिन्नता की भयावहता miRNAs परीक्षण के बीच बेहद अलग था की हद के एक और अधिक कठोर सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदान की ह…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अनुसंधान सार्वजनिक, वाणिज्यिक, या नहीं के लिए लाभ क्षेत्रों में अनुदान एजेंसियों से कोई विशेष अनुदान प्राप्त नहीं किया ।
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
Riferimenti
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