定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量
Summary
このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs の量のより良い理解とさまざまな研究や研究室から対応するデータの質的評価をことができます。
Abstract
RT qPCR は個々 のターゲットの Mirna を評価する最も一般的な方法の 1 つです。Mirna のレベルは一般に参照サンプルを基準にして測定されます。このアプローチは、ターゲット遺伝子の表現のレベルの生理学的変化を調べることに適しています。しかしより良い統計解析を用いた絶対定量遺伝子発現レベルの包括的な評価をお勧めします。絶対定量はまだ共通の使用します。このレポートでは、中古増幅の有無 Rt-qpcr を使用してプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。
EDTA 血漿の固定ボリューム (200 μ L) を意識したカニクイザルの大腿静脈から集められた血から調製した (n = 50)。総 RNA は、市販のシステムを使用して抽出しました。プラズマ miRNAs は miRNA 特定フォワード/リバースの PCR プライマーとプローブを含むプローブ ベースの RT qPCR アッセイによって定量化されました。絶対的な定量化のための標準的な曲線は、市販の合成 RNA オリゴヌクレオチドを使用して生成されました。合成 cel-ミール-238 は、正規化と品質評価のための外部コントロールとして使用されました。35 上記サイクル (Cq) 値の定量化を示した miRNAs は qPCR ステップ前にあらかじめ増幅.
検査 8 Mirna の中では、ミール-122、ミール-133a、ミール 192 ミール 1 とミール-206、ミール 499a の低発現量のため中古増幅に必要なに対しあった中古増幅なし検出。ミール 208a とミール 208b 検出されなかった中古増幅後でさえも。サンプル処理効率は、スパイクの cel ミール 238 の Cq 値で評価しました。この測定法の技術的な変化が 3 倍未満と推定され、定量化 (LLOQ) の下限が 102コピー/μ L、検討の miRNAs のほとんどのため。
このプロトコル プラズマ miRNAs の量のよりよい見積もりを提供でき、さまざまな研究から対応するデータの品質評価。体液、中古増幅 miRNAs の低い数字は悪いの検出を向上に役立ちます考慮した Mirna を表明しました。
Introduction
研究の増加する数の診断と癌の予後のバイオ マーカーとしてマイクロ Rna (Mirna) を探索または監視と非臨床および臨床的研究1,2,3 で他の疾患を検出.定量的リアルタイム逆転写 PCR (RT qPCR) は個々 のターゲットの Mirna を評価するため、この手法はより敏感なマイクロ アレイ4と RNA シーケンス ベースのプラットフォーム5よりも、最も一般的な方法の 1 つであります。一般に、miRNA の表現は、ΔCq 方法6を使用して参照サンプルを基準にして測定されます。このアプローチは、ターゲット遺伝子発現レベルでの生理的変化を調査に適しています。ただし、循環する Mirna の相対的な定量化は、少量のためユーティリティを制限されています。また、技術の変化、異なる所カスタマイズ RT qPCR 実験プロトコル、異なる矛盾につながるかも矛盾に起因するため、さまざまな研究からの結果を比較することは困難異なった調査7。
上記懸念の観点から絶対定量が体液の miRNAs の少量の評価に適してあります。絶対定量法は、対応するターゲット miRNA8と同じシーケンス合成の RNA オリゴヌクレオチドの既知濃度から生成される標準曲線を使用します。保健環境科学研究所 (HESI) ゲノミクス研究会は最近複数のテスト サイトのプラズマ Mirna 絶対測定結果を比較するための包括的な研究を実施しました。結果はことの Mirna 絶対 quantitation のための標準プロトコルを使用して複数のテスト サイト9間で同等の結果をもたらした。本研究では説明されている RT qPCR 測定法は HESI の標準のプロトコルは、複数の miRNA ターゲット、および低式 miRNAs の検出を支援するために中古の増幅の多重分析が含まれていますとほぼ同じです。
本研究では一定量 (200 μ L) EDTA 血漿、血液から調製したが意識したカニクイザルの大腿静脈から収集 (n = 50) 使用10だった。次のプロトコルでは、抽出、miRNA と Rt-qpcr、中古増幅を含む血漿検体の準備のための手順について説明します。もっと重要なは、よく修飾プロセスと組み合わせてターゲット miRNAs サンプルの数量を検証できるように、プロトコルに関する追加の技術情報が、含まれていた。まず、各 miRNA の標準曲線は、生体試料中の定量前にその個々 の検出範囲で検証されました。第二に、現在の方法論の質は、外部コントロール (cel-ミール-238) の Cq 値による総合的に行った。したがって、このプラットフォームでは、さまざまな研究や研究室からの結果を比較するためより有益で信頼性の高いデータが得られます。
8 miRNAs のプロファイルは、代表的な結果としてこのレポートに含まれているここで説明した測定法から。潜在的な安全性バイオ マーカーは、心 (ミール-1、ミール 208a、ミール-208b およびミール 499a) と、齧歯動物および人間3筋 (ミール 133a とミール 206) (ミール 122 とミール 192)、肝臓組織の損傷に関連付けられているこれらの Mirna が提案されています。 11,12,13。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの包括的な評価には、個々 のサンプルのばらつきの大きさだったテスト miRNAs の間で非常に異なることを明示するダイナミック レンジの範囲のより厳密な統計的分析が用意されています。これらのバリエーションは、その少量の体液中に起因するかもしれないが、ことこれらのデータ反映生物学的変化だけでなく、技術的な変化に留意。技術的な変化のほとんどは、他の分析プラット…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、公共、商業、または非営利セクターの資金調達機関から任意の特定の助成金を受信しませんでした。
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
Riferimenti
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