Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR
Summary
Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.
Abstract
RT-qPCR é um dos métodos mais comuns para avaliar os miRNAs destino individual. Níveis de MiRNAs são geralmente medidos em relação a uma amostra de referência. Esta abordagem é apropriada para examinar as alterações fisiológicas em níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação absoluta usando melhor análise estatística é preferível para uma avaliação global dos níveis de expressão do gene. Quantificação absoluta é ainda não de uso comum. Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR, com ou sem pré-amplificação.
Um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA foi preparado a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50). O RNA total foi extraído utilizando sistema comercialmente disponível. Plasma miRNAs foram quantificados por ensaios de RT-qPCR sonda-based, que contém a sonda e a primeira demão PCR de avanço/retrocesso miRNA-específica. Curvas padrão para quantificação absoluta foram geradas usando oligonucleotides de RNA sintéticos disponíveis comercialmente. Um sintético cel-miR-238 foi usado como um controle externo para avaliação de normalização e qualidade. Os miRNAs que mostrou a quantificação ciclo (Cq) valores acima de 35 foram pre-amplificados antes da etapa de qPCR.
Entre os 8 miRNAs examinados, 122-miR, miR-133a e miR-192 foram detectáveis sem pré-amplificação, Considerando que miR-1 e miR-206 miR-499a pré-amplificação por causa de seus níveis baixos de expressão. MiR-208a e miR-208b não foram detectáveis mesmo após pré-amplificação. Eficiência de processamento da amostra foi avaliada pelos valores da cel-miR-238 cravado de Cq. Neste método de ensaio, variação técnica foi estimada em menos de 3 vezes e o limite inferior de quantificação (LLOQ) foi 102 cópia / µ l, para a maioria dos miRNAs examinadas.
Este protocolo fornece uma melhor estimativa da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação da qualidade de correspondentes dados de diferentes estudos. Considerar que o baixo número de miRNAs em fluidos corporais, pré-amplificação é útil para realçar a deteção de mal expressa miRNAs.
Introduction
Um número crescente de estudos foram explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico de câncer, ou monitoramento e detecção de outras doenças em estudos clínicos e adequado1,2,3 . Quantitativo em tempo real transcrição reversa PCR (RT-qPCR) é um dos métodos mais comuns utilizados para avaliar os miRNAs destino individual, porque esta técnica é mais sensível do que microarray4 e sequenciamento de RNA baseiam plataformas5. Em geral, expressão de miRNA é medido em relação a uma amostra de referência usando o método de ΔCq6. Esta abordagem é apropriada para investigar mudanças fisiológicas nos níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação relativa de miRNAs em circulação tem limitado utilitário por causa de suas pequenas quantidades. Além disso, variação técnica torna difícil comparar os resultados de estudos diferentes, porque diferentes laboratórios personalizar os protocolos experimentais RT-qPCR diferente, que leva a inconsistente ou contraditório mesmo resulta da diferentes estudos7.
Tendo em conta as preocupações acima mencionadas, a quantificação absoluta pode ser mais adequada para a avaliação das quantidades pequenas de miRNAs em fluidos corporais. O método de quantificação absoluta usa uma curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas de oligonucleotides RNA sintéticos idênticos em sequência ao destino correspondente miRNA8. A saúde e a Comissão técnica do Instituto de ciências ambientais (HESI) na genômica recentemente conduziram estudos abrangentes para comparar os resultados de medições absolutas de plasma miRNAs, através de vários sites de teste. Os resultados mostraram que usando um protocolo padrão para a quantificação absoluta de miRNAs produziu resultados comparáveis entre os múltiplos de sites teste9. O método de ensaio de RT-qPCR descrito no presente estudo é quase idêntico ao protocolo padrão do HESI, que inclui análise multiplexada de múltiplos alvos de miRNA e pré-amplificação para auxiliar a detecção de baixa expressão miRNAs.
Neste estudo, um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA preparada a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50) foi utilizado10. O protocolo seguinte descreve o procedimento para a preparação de amostras de plasma, extração de miRNA e RT-qPCR, incluindo pré-amplificação. Mais importante ainda, informações técnicas adicionais sobre o protocolo foi incluídas, para que a quantidade de alvo miRNAs nas amostras pode ser validada em combinação com um processo bem qualificado. Primeiro, a curva padrão de cada miRNA foi validada para a sua gama de deteção individuais, antes da sua quantificação, em amostras biológicas. Em segundo lugar, a qualidade da metodologia atual foi exaustivamente avaliada através de valores de Cq de um controle externo (cel-miR-238). Portanto, esta plataforma produz dados mais informativos e confiável para comparar resultados de diferentes estudos ou laboratórios.
Os perfis dos 8 miRNAs foram incluídos neste relatório como resultados representativos do método de ensaio descrito aqui. Estes miRNAs têm sido propostos como potenciais biomarcadores de segurança associados a lesões de tecidos para o fígado (miR-122 e miR-192), coração (miR-1, miR-208a, miR-208b e miR-499a) e o músculo esquelético (miR-133a e miR-206) em roedores e humanos3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nossa avaliação abrangente fornecido uma análise estatística mais rigorosa da extensão da faixa dinâmica, que indicava claramente que a magnitude da variação entre amostras individuais foi extremamente diferente entre os miRNAs testados. Embora estas variações podem ser atribuíveis à suas pequenas quantidades em fluidos corporais, note-se que esses dados refletem não apenas variações biológicas, mas também variações técnicas. A maioria da variação técnica pode ser avaliada por meio de valores de Cq…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa não recebeu qualquer subsídio específico de agências de financiamento no setor público, comercial ou não-lucrativa.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
Riferimenti
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