Aprimoramento do modelo de suínos do miocárdio peito fechado pela padronização do tecido e os procedimentos de recolha de amostras de sangue
Summary
Aqui vamos demonstrar um protocolo para padronizar os procedimentos de amostragem de um modelo estabelecido de suínos de infarto agudo do miocárdio, a fim de aumentar seu valor de translação no entendimento da fisiopatologia da lesão de isquemia/reperfusão miocárdica e para testar candidatos a novos fármacos.
Abstract
Reperfusão de isquemia miocárdica (eu / R) lesão contribui para quase metade da área necrótica após infarto do miocárdio. Até à data, não há nenhuma droga aprovada para evitar ou reduzir miocárdica eu / lesão R. O estudo e compreensão dos mecanismos fisiopatológicos do miocárdio eu / R lesão é essencial para desenvolver tratamentos bem sucedidos. Experiências com animais grandes são um passo importante na translação métodos. O modelo suíno de infarto agudo do miocárdio foi estabelecido e descrito por nós mesmos e os outros. Objetivo melhorar ainda mais o valor do modelo, concentrando-se em detalhes sobre as técnicas de amostragem para uso em experimentos futuros. Além disso, Ressaltamos a passos pequenos, mas importantes que podem afetar a qualidade do resultado final. Para imitar a situação clínica do miocárdio eu / lesão R, um cateter de intervenção coronária percutânea (PCI) foi inserido no esquerdo artéria descendente anterior coronária (rapaz) de um porco anestesiado. ° ° ° Este modelo imita infarto agudo do miocárdio e tratamento PCI em seres humanos com a possibilidade de determinar com precisão a área de risco assim como a necrose- e tecido isquêmico viável. Aqui, o modelo foi usado para investigar o efeito de um inibidor de peptídeo bicíclico de FXIIa. O modelo também pode ser modificado para permitir tempos de reperfusão mais estudar os efeitos posteriores de infarto do miocárdio.
Introduction
Doença isquêmica do coração, em especial infarto agudo do miocárdio (MI), é a principal causa de morte em países desenvolvidos 1. Hoje, o tratamento padrão de MI é intervenção coronária percutânea (PCI), o tratamento de cateter de balão. Um dos fatores críticos que afeta a qualidade de vida e o prognóstico de pacientes após MI aguda tratada com PCI são o tamanho do infarto. A redução do tamanho pode ter um grande impacto na para sobrevivência e prognóstico do paciente 2. Isquemia/reperfusão miocárdica (eu / R) lesão tem uma influência significativa sobre o tamanho do infarto por um dos principais objectivos em pesquisa cardiovascular é evitar ou reduzir miocárdica eu / R lesão 3. Os mecanismos exatos de I / lesão R estão ainda sob investigação 4. Ativação das cascatas de plasma e as células endoteliais são marcas registradas de I / R lesão 5. Ativação do sistema de coagulação é claramente envolvidos 6,7. Recentemente, o papel do FXII, como um início peptídeo montante envolvido na ativação de contato fase da cascata da coagulação, tem sido demonstrado em um FXII nocautear modelo do rato de cerebral eu / R lesão 8. Validação destes resultados em um modelo de suínos é um passo importante na tradução clínica. Portanto, estamos testando um inibidor de FXIIa romance bicíclico (80 kDa protease) no contexto do miocárdio eu / lesão R em um estudo piloto.
Modelos animais, que imitam a situação clínica de tratamentos MI e PCI agudas, são essenciais para melhorar a nossa compreensão da fisiopatologia do miocárdio eu / lesão R e testar as opções de tratamento de novela. Os porcos representam um bom modelo animal para clínicos miocárdica eu / lesão R. Isto não é só porque seus corações são muito semelhantes aos corações humanos no que diz respeito a anatomia e circulação coronária, mas eles também mostram respostas fisiopatológicas semelhantes a miocárdica isquemia e reperfusão 9,10. Outros modelos tais como ratos e camundongos não cumprir esses critérios e mostrar diferenças consideráveis em relação de corações humanos 11,12, Considerando que os cães por exemplo, têm muitos vasos coronarianos colaterais, mais, em comparação com os seres humanos 13.
O modelo de suínos infarto agudo do miocárdio tem sido amplamente utilizado em pesquisa cardiovascular para investigar a doença de coração isquêmica incluindo miocárdica eu / R lesão 14,15,16,17. O último é uma condição inflamatória, por causa do qual minimizando a reação inflamatória relacionada a esternotomia ou toracotomia usada na cirurgia de peito aberto é essencial. O modelo de peito fechado usando uma configuração de angiografia C-braço clínica resolve este problema. Além disso, um dos pontos mais importantes é que nosso protocolo fornece uma distinção exata entre isquêmica (área de risco, AAR) e áreas não-isquêmicas do ventrículo esquerdo (área de risco, ANR) para que o tamanho do infarto (tecido necrótico isquêmico, NIT) pode ser determinado com precisão. O nosso objectivo para este papel é definir claramente uma metodologia reproduzível de um suíno miocárdica eu / lesão R modelo, em particular no que diz respeito a amostragem do tecido do miocárdio, que permitirá uma análise mais precisa dos mecanismos moleculares de I / lesão R e um mais clara dos efeitos dos tratamentos com drogas novas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miocárdica eu / lesão R tem um efeito significativo no tamanho final de infarto que é traduzido diretamente para o prognóstico do paciente após infarto agudo do miocárdio3. Entendimento da fisiopatologia do miocárdio eu / lesão de R é o primeiro passo para reduzir ou evitar isso. Miocárdica eu / lesão R é uma condição aguda que ocorre diretamente após a reperfusão dos vasos obscurecidos. Eu / lesão R leva à ativação da resposta imune inata e dano celular ocorre no local da repe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer o Professor Christian Heinis para fornecer o inibidor FXIIa e o respectivo controle. Reconhecemos também com gratidão Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler e Kay Nettelbeck da unidade de Cirurgia Experimental, departamento de pesquisas biomédicas, Universidade de Berna, para suporte técnico. Celine Guillod e Matthias Rausch do departamento para diagnóstico, intervencional e radiologia pediátrica, Hospital Universitário de Berna, Inselspital fornecido com o equipamento de raios-x e técnicas. Este projecto foi financiado pela Swiss National Science Foundation, projeto n. º 320030_156193. Também gostaríamos de agradecer o Sr. Reto Haenni de comunicação e marketing, Hospital Universitário de Berna, Inselspital para nossa experiência de gravação de vídeo.
Materials
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | – | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | – | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | – | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | – | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | – | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | – | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | – | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | – | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | – | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | – | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | – | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | – | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | – | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | – | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | – | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | – | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | – | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | – | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | – | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
Riferimenti
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -. W., Underwood, M. J., Yu, C. -. M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion – ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery?. Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
