Identifikation af OTX1 og OTX2 som to mulige molekylære markører for Sinonasal karcinomer og olfaktoriske Neuroblastomas
Summary
HOXD gener er regulerings gener ofte forbundet med tumorer i de voksne organismer. Vi undersøgt deres komparative udtryk ved immunhistokemiske og real-time PCR analyse, i normal og inflammatoriske nasal mucosae og sinonasal neoplasmer for at bruge dem som mulige diagnostiske og terapeutiske mål.
Abstract
OTX HOXD (HB) gener er udtrykt under embryonale morfogenese og under udviklingen af Lugtepithelet i voksen organismer. Mutationer i disse gener er ofte knyttet til tumordannelse i human. Ingen data er tilgængelige i dag med hensyn til den mulige sammenhæng mellem OTX gener og tumorer i næsehulen. Formålet med dette arbejde er at forstå, hvis OTX1 og OTX2 kan betragtes som molekylære markører i udviklingen af nasal tumorer. Vi valgte nasal og sinonasal adenocarcinomer at undersøge udtryk for OTX1 og OTX2 gener gennem immunhistokemiske og real-time PCR analyser. Både OTX1 og OTX2 var fraværende i alle prøver af sinonasal tarm-Type adenocarcinomer (ITACs). OTX1 mRNA blev identificeret kun i Non-tarm Type adenocarcinomer (NITACs), mens OTX2 mRNA blev udtrykt kun i olfaktoriske Neuroblastomas (ONs). Vi har demonstreret, at den differentiale genekspression for både OTX1 og OTX2 gener kan være en nyttig Molekylær markør for at skelne de forskellige typer af sinonasal tumorer.
Introduction
OTX HB gener er de hvirveldyr homolog Drosophila orthodenticle gener (otd) og de koder for transkriptionsfaktorer, der udtrykkes normalt i løbet af embryonale morfogenese, men de kan også udtrykkes i den voksne organisme med forskellige funktioner . Under fosterudviklingen kontrollerer de specifikation af celle-id’et, Celledifferentiering og positionering af kroppen axis¹. Familien OTX omfatter OTX1 og OTX2 gener, som viser forskellige funktioner. OTX1 er involveret i hjernen og sanseorgan udvikling. Den voksne organisme, det er udtrykt i sanseorganer og er transskriberet på et lavt niveau i den anteriore lap på hypofysen2; det spiller også en rolle i bloddannelsen, udtrykkes i hæmatopoietisk pluripotente og stamfader celler3. OTX2 er involveret i udviklingen af den rostralt hoved og sin oversatte protein-fungerer som en morphogen fordi det genererer et forløb gennem hvilke andre gener er aktiveret eller undertrykt i en spatio-temporale måde og dermed bidrage til celle spredning og differentiering. I den voksne organisme findes OTX2 udelukkende i chorioideus plexus og pinealkirtlen4.
Mutationer i OTX gener er ofte knyttet til udseendet af menneskets medfødte, somatiske eller metabolisk mangler. Tab eller gevinst mutationer i gener, OTX kunne fremme tumordannelse, hvis de ikke er i stand til korrekt styrer cellulære vækst og/eller differentiering5. I leukæmi og lymfomer samt mange solide tumorer (fx medulloblastomas6, aggressive ikke-Hodgkin lymfomer2, bryst karcinomer7, tyktarms-og endetarmskræft8og Retinoblastom9), den dereguleret udtryk for OTX HB gener er veldokumenteret10. Derudover er OTX2 mutationer blevet påvist i tilfælde af anophthalmia og microphtalmia11 på grund af den afgørende rolle for dette gen i kontrollen af øjet udvikling.
I forbindelse med solid neoplasmer er opdagelsen af molekylære og fænotypiske markører en vigtig udfordring for diagnose, klassificering og behandling af flere typer af tumor11, herunder dem, der har oprindelse i næsehulen og paranasalis bihuler. Faktisk, trods at disse områder indtager kun et beskedent anatomiske rum, slimhinde epitel, kirtler, bløde væv, knogler, brusk eller neural/neuroectodermal, og hematolymphoid celler kan ofte stedet for oprindelsen af komplekse og histologisk adskiller grupper af tumorer. Forskellige typer af neoplasmer involverer sinonasal tarmkanalen præsentere en række funktioner, der overvinde hvad der normalt ses i den øverste aerodigestive tarmkanalen eller endda hele de fleste dele af kroppen12. Sinonasal maligne sygdomme er sjældne og fremlægge en årlig incidens af 1:100,000 indbyggere på verdensplan, og så forhindrer undersøgelser vedrørende veje involveret i tumordannelse og afprøvning af alternative behandling strategier. På trods af dette fremskridt i imaging teknikker, har kirurgisk tilgange, og strålebehandling forbedret den kliniske behandling af sinonasal kræft. Desuden udviklingen af cellelinjer og dyremodeller samt kræft genetisk profilering i øjeblikket udgør grundlaget for fremtidige målrettede anticancer behandlinger13. Til dato, er der ingen rapporter om OTX1 og/eller OTX2 udtryk i neoplasmer af næsehulen, paranasalis bihuler og nasopharynx. Da vi har tidligere observeret at OTX1 og OTX2 er involveret i bryst kræft7, vi spekulerede på, hvis disse gener kan være til stede i normale næseslimhinden, men også i tumorer af næsehulen. At nå dette mål, vi fik fra Institut patologi af den “Ospedale di Circolo” i Varese prøver af normale slimhinde og nasal og sinonasal adenocarcinomer indsamlet fra 1985 til 2012 og klassificeret ifølge World Health organisation (WHO) klassificering af hoved og hals tumorer. Vi vælger at analysere dem gennem real-time PCR og Immunhistokemi analyser og vi vurderet, OTX1 og OTX2 udtryk for at afgøre, om de kan anses molekylære markører for disse typer af tumorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse viser for første gang, at baseret på mRNA niveau, HB gener OTX1 og OTX2 er udtrykt i normal sinonasal slimhinde og submukøse kirtler, inflammatoriske polypper, sinonasal Schneiderian papillomer, og i de forskellige epitel og neuroectodermal neoplasmer, herunder planocellulære karcinomer, ikke-tarm type sinonasal adenocarcinomer, spytkirtel-type tumorer, neuroendokrine svulster og ONs.
Ændringer og fejlfinding:
For at undgå RNA nedbrydning, udf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Centro Grandi at Università dell’Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia og Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
Riferimenti
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence?. Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. . World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
