Identifiering av OTX1 och OTX2 som två möjliga molekylära markörer för Sinonasal carcinom och lukt Neuroblastomas
Summary
Homeobox gener är regleringsgener som ofta förknippas med tumörer i den vuxna organismen. Vi undersökte deras jämförande uttryck av immunhistokemiska och realtids PCR-analys, i normal och inflammatoriska näsans slemhinnor och sinonasal tumörer för att använda dem som möjliga diagnostiska och terapeutiska mål.
Abstract
OTX homeobox (HB) gener uttrycks under embryonala morfogenes och under utvecklingen av luktepitel i vuxna organismer. Mutationer i dessa gener är ofta relaterade till tumourigenesis i mänskliga. Inga data finns tillgängliga idag angående möjliga sambandet mellan OTX gener och tumörer i näshålan. Syftet med detta arbete är att förstå om OTX1 och OTX2 kan betraktas som molekylära markörer i utvecklingen av nasala tumörer. Vi valde nasal och sinonasal adenokarcinom att undersöka uttrycket av OTX1 och OTX2 gener genom immunhistokemisk och realtids PCR-analyser. Både OTX1 och OTX2 var frånvarande i alla prover av sinonasal intestinala-typen adenokarcinom (ITACs). OTX1 mRNA identifierades endast i icke-Intestinal typ adenokarcinom (NITACs) medan OTX2 mRNA uttrycktes endast i lukt Neuroblastomas (ONs). Vi har visat att differential genuttrycket för både OTX1 och OTX2 gener kan vara en användbar molekylär markör för att skilja olika typer av sinonasal tumörer.
Introduction
OTX HB gener är det vertebrate homologt Drosophila orthodenticle gener (otd) och de kodar för transkriptionsfaktorer som uttrycks normalt under embryonala morfogenes, men de kan också uttryckas i den vuxna organismen med olika funktioner . Under Embryonalutvecklingen styr de specifikationen av cellidentiteten, celldifferentiering och placeringen av den kropp axis¹. OTX familjen innehåller OTX1 och OTX2 gener som visar olika funktioner. OTX1 är involverad i hjärnan och sensoriska organ utveckling. I den vuxna organismen, det uttrycks i sinnesorgan och transkriberas på låga nivåer i den främre loben av hypofysen2; den spelar också en roll i blodbildning, uttrycks i hematopoetiska pluripotenta och stamceller celler3. OTX2 är involverad i utvecklingen av rostralt huvudet och dess översatta protein agerar som en morphogen eftersom det genererar en övertoning genom vilka andra gener är aktiverat eller förträngt i en plats och tid tidsramar och därigenom bidra till cell proliferation och differentiering. I den vuxna organismen finns OTX2 uteslutande i den koroidea plexus och tallkottkörteln4.
Mutationer i gener som OTX är ofta relaterade till uppkomsten av människans medfödda, somatiska eller metaboliska defekter. Vinst eller förlust-mutationer i gener som OTX kunde främja uppkomst om de inte kunna korrekt styra cellulära tillväxt och/eller differentiering5. Leukemier och lymfom samt liksom många solida tumörer (t.ex. medulloblastomas6, aggressiva non-Hodgkin lymfom2, bröstcancer carcinom7, kolorektal cancer8och retinoblastom9), den avreglerad uttryck av OTX HB gener är väldokumenterade10. Dessutom har OTX2 mutationer påvisats i fall av anoftalmi och mikroftalmi11 på grund av den avgörande rollen för denna gen i kontrollen av ögats utveckling.
I samband med solida tumörer är upptäckten av molekylära och fenotypiska markörer en viktig utmaning för diagnos, klassificering och behandling av flera typer av tumör11, inklusive de som har sitt ursprung i näshålan och paranasal bihålorna. I själva verket, trots att dessa områden upptar endast en blygsam anatomiska utrymme, slemhinnorna epitel, körtlar, mjuka vävnader, ben, brosk eller neurala/neuroektodermala, och hematolymphoid celler kan vara ofta webbplatsen för komplexa och histologiskt olika ursprung grupper av tumörer. Olika typer av tumörer som omfattar den sinonasal tarmkanalen presenterar en mängd funktioner som övervinna vad som vanligtvis ses i övre aerodigestive tarmkanalen eller även under de flesta delar av kroppen12. Sinonasal maligniteter är sällsynta och lägga fram en årlig incidens av 1:100,000 invånare världen över, och så detta förhindrar studier om vägarna som är inblandade i tumourigenesis och testning av alternativa behandlingsstrategier. Trots detta framsteg inom imaging tekniker, har kirurgiska metoder, och strålbehandling förbättrat klinisk hantering av sinonasal cancer. Dessutom utveckling av cellinjer och djurmodeller samt cancer genetisk profilering för närvarande utgör grunden för den framtida målinriktad cancerbehandling13. Hittills finns det inga rapporter om OTX1 eller OTX2 uttryck i tumörer av näshålan, bihålorna och nasofarynx. Eftersom vi har tidigare konstaterat att OTX1 och OTX2 är inblandade i bröst cancer7, undrade vi om dessa gener kunde närvara inte bara i den normala nässlemhinnan men också i tumörer i näshålan. Att nå detta mål som vi fått från Institutionen för patologi av den ”Ospedale di Circolo” i Varese prover av normal slemhinna, och nasal och sinonasal adenokarcinom samlas in från 1985 till 2012 och klassificeras enligt den Världshälsoorganisationen (WHO) klassificering av huvud och hals tumörer. Vi väljer att analysera dem genom realtids PCR och immunohistokemi analyser och vi utvärderat OTX1 och OTX2 uttryck för att avgöra om de kan anses molekylära markörer för dessa typer av tumörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie visar för första gången att, baserat på mRNA nivåer, HB generna OTX1 och OTX2 uttrycks i normala sinonasal slemhinna och submukösa körtlar, inflammatoriska polyper, sinonasal Schneiderian papillom och i de olika epitelial och neuroektodermala tumörer, inklusive skivepitelcancer karcinom, icke-intestinal typ sinonasal adenokarcinom, spottkörtel-typ tumörer, Neuroendokrina tumörer och ONs.
Modifieringar och felsökning:
För att undvika RNA nedbry…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Centro Grandi att Università bara, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia och Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
Riferimenti
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence?. Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. . World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
