スポット (tRNA を観察するための合理化されたプラットフォーム) の名前、元のトランスファー RNA 解析プラットフォームについて述べる。スポットは、生体試料中唯一の 3 つの手順で、24 時間以内にすべての tRNAs の細胞レベルを同時に測定します。
トランスファー Rna (tRNA) が豊富な短い非コード RNA 種通常 76 に 90 のヌクレオチド長であります。Trna は mRNA のコドンをアミノ酸配列に翻訳することによってタンパク質合成を直接担当です。Trna は長い規制機能に欠けていた家は維持分子として考慮されました。ただし、証拠の成長するボディは、セル型、環境、ストレスなどさまざまな条件に対応携帯電話の tRNA のレベルが変動することを示します。TRNA 表現の揺らぎは、優遇または特定蛋白質の発現を抑制遺伝子翻訳を直接影響します。最終的にタンパク質合成の動的を理解と、高品質の tRNA のプロファイルを提供することができる方法の開発が必要です。ここで紹介する方法は、スポット観測 tRNA の合理化されたプラットフォームの略という名前です。スポットは、放射性の総 Rna のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出が続く放射性の正燐酸塩と培養細胞の代謝ラベリングで始まる 3 つの手順で構成されています、最後に社内で交配の印刷macroarrays。tRNA のレベルを推定するには、プローブの各スポットで放射能強度の定量化します。ここで提示されたプロトコルアラビノースイソメラーゼmc2155、結核を研究するモデル生物としてよく使用されます非病原性細菌の Trna をプロファイルします。
セルの種類・環境・ ストレス1,2,3などの条件によると携帯電話の tRNA のレベルが変動します。スポット、tRNA を観察するための合理化されたプラットフォームは、元、信頼性の高い研究所成長生物の転移 RNA レベルの高速高精度の定量化ができる簡単なテクニックです。
Trna は、非常に安定した二次および第三構造4を持っています。また、多数の転写後変更5を表示します。これらの機能は、重要な構造とシーケンス障害バイアスまたは防止 tRNA プロファイル標準ベンチマーク RNA 定量技術6を使用して直接かつ再現性を表します。世界中の研究グループは、細胞の tRNA のレベルを評価するために創造的な多くの場合複雑な技術の開発を余儀なくされました。これらのメソッドのいくつかを含める: 代謝ラベルの付いた Trna (1) 二次元電気泳動分離は北のしみ1整然としたスポット割り当てと組み合わせる(北に 2) 個々 の定量化のしみを使用して慎重に標準化された放射性 DNA プローブ7;(続いて 3) ポスト抽出ラベリング シアニン螢マイクロ アレイ解析3と (4)の in vitro遺伝子組換え demodification 酵素逆のトランスクリプションと組み合わせるとそれ以降を使用して tRNA 変更のストリップ高スループット シーケンス8。
スポットは 2 つのスタンダードでシンプルなアプローチのシンプルで元の組み合わせ: (1) RNA の体ラベリング、合成は、成長する生物、放射性の総 Rna や tRNA (2) macroarrays、体系的かつ小型化されたゲノムのツールで構成されていますtRNA の分離のために最適化されています。
サンプルは、生物から定量化プラットフォームに合理化します。彼らは抽出後直接分析し、さらにポスト抽出増幅または酵素治療を必要とする技術と比較してバイアスが大幅に制限されるに処理されません。スポットは多目的、リボソームの翻訳に物理的に関連付けられている tRNA サブポピュレーションの定量化ポリソーム分別に簡単に組み合わせることができます。
ここで提示されたプロトコルがアラビノースイソメラーゼ、最適化され、大腸菌9、酵母10マウスとヒトの細胞培養11 でプロファイル Trna にも正常に使っていました.
ベータ粒子の放出は、テストの範囲に放射セル フィットネスにも大きな影響を与えるしかし静菌と殺菌剤14、知られています。シンチレーションを示した放射能が全細胞抽出液の 25%、その後、浄化された総 Rna の 1% に組み込まれています。
プローブの同一サイズ、同等の溶解温度と GC コンテンツ、macroarray のスポッティング、統一プロトコル交配および定量化のスポット信号から直接レベルの tRNA の公平な測定できます。
スポットは、再現性と特定です。その広いダイナミック レンジと簡単に調整可能なしきい値により、配列露出度9を延長することにより単にポリソームに関連付けられている Trna などの低豊富な種をプロファイリングします。必要な設備の初期投資後の消耗品を含むサンプル当たりのランニング コスト サンプルあたり 15 ドルの平均値します。
スポットは、あらゆる有機体のゲノムはプローブ設計のために適用されます。試験管内で栽培されているモデル生物は、代謝ラベリングを理想的な候補です。哺乳類のゲノムはしばしば多くの isodecoders (Trna と同じ anticodons を共有するものの、彼らのボディのシーケンスの小さい相違を表示) をエンコード、プローブは閉じる tRNA 種の同種交配を維持するために部分的に退化した必要があります。最後に、付着性の哺乳類セルは通常低い文化を大幅にスケール アップする必要があるので、 M. smegmatisなどペンションで成長した有機体と比較して総 RNA 量を得られます。
The authors have nothing to disclose.
この作品が支持された SC INBRE 付与から国立科学研究所の一般医療 – NIH によって (r. g. に P20GM103499) し、国立がん研究所から P.H.H. に CA555536 ・ CA154664 を付与このプログラム部分で支えられましたチャールストン大学に就学及び学部科学教育プログラムによってハワード ヒューズ医学研究所からの助成金によって、センターからの助成金によって研究資源 (5 P20 RR016461)国立科学研究所の一般医療 (8 P20 GM103499) 国立衛生研究所から。
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |