Describimos a una plataforma de análisis de ARN de transferencia original llamada SPOt (plataforma optimizada para la observación de tRNA). Lugar simultáneamente mide los niveles celulares de todos los tRNAs en muestras biológicas, en sólo tres pasos y en menos de 24 horas.
RNAs de transferencia (tRNA) son cortos no codificante del RNA especies abundantes que son típicamente de 76 a 90 nucleótidos de longitud. tRNAs son directamente responsables de la síntesis de proteínas por traducción de codones en el ARNm en secuencias del aminoácido. tRNAs durante mucho tiempo fueron considerados como moléculas de mantenimiento de la casa que carecían de funciones reguladoras. Sin embargo, un creciente cuerpo de evidencia indica que los niveles celulares de tRNA fluctúan en correspondencia a las condiciones variables tales como tipo de la célula, medio ambiente y el estrés. La fluctuación de la expresión de tRNA influye directamente en traducción de gene, favorece o reprime la expresión de proteínas particulares. En última instancia, comprender la dinámica de la síntesis de proteínas requiere el desarrollo de métodos capaces de ofrecer perfiles de tRNA de alta calidad. El método que presentamos aquí se llama SPOt, acrónimo de plataforma optimizada para el tRNA de la observación. Terreno consta de tres pasos a partir de etiquetado metabólico de cultivos celulares con ortofosfato radiactivo, seguido por la extracción de guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo de RNAs totales radiactivos y finalmente hibridación en el propio impreso macroarrays. se estiman que los niveles de tRNA mediante la cuantificación de las intensidades de la radiactividad en cada punto de la sonda. En el protocolo presentado aquí perfilamos tRNAs en Mycobacterium smegmatis mc2155, una bacteria no patógena de uso frecuente como un organismo modelo para el estudio de la tuberculosis.
Niveles celulares de tRNA fluctúan según las condiciones como el tipo de la célula, medio ambiente y estrés1,2,3. Lugar, plataforma optimizada para la observación de tRNA, es original, confiable y sencilla técnica que permite la cuantificación rápida y precisa de los niveles de ARN de transferencia en organismos de laboratorio-crecido.
tRNAs tienen estructuras secundarias y terciarias notablemente estable4. También mostrarán numerosas modificaciones post-transcripcionales5. Estas características representan estructural significativo y obstáculos de la secuencia de polarización o prevenir a veces directo y reproducible tRNA perfiles de uso de técnicas de cuantificación de RNA de referencia estándar6. Grupos de investigación alrededor del mundo se vieron obligados a desarrollar técnicas creativas pero a menudo enrevesadas para evaluar los niveles celulares de tRNA. Algunos de estos métodos incluyen: (1) separación electroforética bidimensional de tRNAs metabólicamente etiquetado combinado con asignación punto metódico por Northern blot1; (2) cuantificación individual por Northern blot usando cuidadosamente estandarizada radiactivo DNA sondas7; (3) post extracción etiquetado con fluorocromos de Cianina seguido por análisis de microarray3y (4) en vitro de modificaciones de tRNA mediante enzimas recombinantes demodification combinadas con la reversa de la transcripción y posterior secuenciación de alto rendimiento8.
Es una sencilla y original combinación de dos enfoques estándar y sencillos: cuerpo (1) RNA de etiquetado, que consiste en la síntesis, en el cultivo de organismos, de RNAs totales radiactivos y macroarrays tRNA (2), una herramienta genómica sistemática y miniaturizada optimizado para segregación de tRNA.
Las muestras son racionalizadas de organismos vivos a la plataforma de cuantificación. Se analizan directamente después de la extracción y procesado no más lejos que limita significativamente los prejuicios frente a técnicas que requieran amplificación post extracción o tratamientos enzimáticos. Es versátil y se puede combinar fácilmente a fraccionamiento polysome para identificar y cuantificar las subpoblaciones de tRNA físicamente asociados con la traducción de los ribosomas.
El protocolo presentado aquí está optimizado para Mycobacterium smegmatis, y fue utilizado también con éxito a perfil tRNAs en Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, ratón y células humanas culturas11 .
Emisiones de partículas beta son conocidas agentes bacteriostáticos y bactericidas14, pero las radiaciones en el rango probado ningún impacto significativo en la aptitud de la célula. Conteo por Cintilación demostró que la radiactividad se incorpora en el 25% de extractos celulares total y posteriormente, el 1% del ARN total purificada.
Las sondas tamaños idénticos, temperatura de fusión comparable y contenido de GC, junto con un protocolo uniforme para macroarray manchado, hibridación y cuantificación permite medición imparcial de niveles de tRNA de señales de lugares.
Punto es reproducible y específica. Su amplio rango dinámico y umbral fácilmente ajustable permite perfiles bajo especies abundantes, como tRNAs asociados a polisomas, simplemente por la prolongación de la matriz de tiempos de exposición9. Después de la inversión inicial para el equipo necesario, el funcionamiento costo por muestra, incluyendo consumibles, un promedio de $15 por muestras.
Punto es aplicable a cualquier organismo cuyo genoma está disponible para el diseño de la sonda. Organismos modelo que se cultivan en vitro son candidatos ideales para el etiquetado metabólico. Como genomas mamíferos codifican a menudo muchos isodecoders (tRNAs que comparten idénticos anticodones pero mostrar pequeñas diferencias en sus secuencias de cuerpo) las puntas de prueba deben ser parcialmente degenerado para preservar la hibridación homogéneo de cerca especies de tRNA. Finalmente, adherentes de células de mamífero producen normalmente menos cantidad de ARN total en comparación con organismos cultivados en suspensión tales como M. smegmatis, culturas necesitar ampliarse sustancialmente.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por una subvención de INBRE SC de la National Institute of General Medical Science – NIH (P20GM103499 a R.G.) y CA555536 y CA154664 del Instituto Nacional del cáncer a P.H.H. Este programa fue apoyado en parte por una beca para la Universidad de Charleston de la Howard Hughes Medical Institute a través de la pre-college & licenciatura ciencia educación y subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (5 RR016461 P20) y el nacional Instituto de General ciencias médicas (8 P20 GM103499) de los institutos nacionales de salud.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |