我们描述了一个原始的传输 RNA 分析平台名为 SPOt (简化的观察 tRNA 平台)。斑点同时测量所有转运在生物样品中的细胞水平, 仅三步, 并在不到24小时。
转移 rna (tRNA) 是丰富的短编码 RNA 种类, 通常是76到90核苷酸的长度。转运直接负责蛋白质的合成, 将密码的 mRNA 转化为氨基酸序列。长久以来, 转运被认为是缺乏监管功能的内部分子。然而, 越来越多的证据表明, 细胞 tRNA 水平在对应的变化条件, 如细胞类型, 环境, 和压力波动。tRNA 表达的波动直接影响基因的翻译, 有利于或抑制特定蛋白质的表达。最终理解蛋白质合成的动态需要开发能够提供高质量的 tRNA 剖面的方法。我们这里提出的方法被命名为 SPOt, 它代表了用于观察 tRNA 的流线型平台。斑点由三步开始以细胞培养的新陈代谢的标记与放射性磷酸盐, 其次胍硫氰酸盐-苯酚-氯仿提取放射性总 rna 和最后杂交在 in-house 打印macroarraystRNA 水平的估计, 量化的放射性强度在每个探针点。在这里提出的协议中, 我们在分枝杆菌耻mc2155 转运, 一个致病细菌经常被用作模型生物体来研究结核病。
细胞 tRNA 水平的波动根据条件, 如细胞类型, 环境, 和压力1,2,3。现场, 简化的观察 tRNA 的平台, 是一个原始的, 可靠的, 直接的技术, 允许快速和精确的量化的转移 RNA 水平的实验室培养的有机体。
转运具有显著稳定的二级和三级结构4。它们还显示许多后修改5。这些特征代表重要的结构和序列路障偏置, 或有时阻止使用标准的基准 RNA 量化技术6进行直接和可重现的 tRNA 分析。世界各地的研究小组被迫发展创造性的, 但往往是复杂的技术来评估细胞 tRNA 水平。其中的一些方法包括: (1) two-dimensional 电泳分离新陈代谢标记转运结合有条理的斑点分配的北印迹1;(2) 使用经过仔细标准化的放射性 DNA 探针的北印迹的个体量化7;(3) 蒜标记与菁荧光其次是微阵列分析3, 和 (4)体外剥离 tRNA 修饰使用重组 demodification 酶结合反转转录和随后高通量排序8。
斑点是两个标准和直接的方法的简单和原始的组合: (1) RNA 身体标记, 包括在生长的有机体, 放射性总 rna 和 (2) tRNA macroarrays, 系统和微型基因组工具优化 tRNA 隔离。
样品从活有机体被简化到定量平台。他们是直接分析后提取, 而不是进一步处理, 大大限制了偏见相比, 需要蒜放大或酶治疗技术。斑点是多才多艺的, 可以很容易地结合到 polysome 分馏, 以确定和量化 tRNA 亚群, 与翻译核糖体的物理联系。
此处介绍的协议针对分枝杆菌耻进行了优化, 并且还成功地用于在大肠杆菌9、酿酒酵母10、鼠标和人类细胞培养中对转运进行剖面分析11.
β粒子的排放是已知的抑菌和杀菌剂14, 但是在测试范围内的辐射对细胞的适应性没有显著影响。闪烁计数表明, 放射性被纳入25% 的总细胞提取物, 随后, 1% 的纯化总 rna。
探测器的大小相同, 熔点和 GC 含量相同, 同时 macroarray 斑点、杂交和定量的统一协议允许直接从 spot 信号中测量 tRNA 水平。
现货是可重现和具体的。它的大动态范围和易于调整的门槛允许分析低丰富的物种, 如转运与聚, 只需延长阵列曝光时间9。在对所需设备进行初步投资后, 每个样品的运行费用, 包括消耗品, 平均每样15美元。
斑点适用于任何生物体, 其基因组可用于探针设计。在体外生长的模型生物体是新陈代谢标记的理想候选者。由于哺乳动物的基因组经常编码许多 isodecoders (转运, 共享相同的 anticodons, 但显示在他们的身体序列的细微差异) 探针需要部分退化, 以保存接近 tRNA 物种的同源杂交。最后, 与悬浮物中生长的生物体相比, 附着在哺乳动物细胞中的总 RNA 的数量要低得多, 例如m 耻, 所以文化需要大幅度地扩大。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国立医学研究所 (NIH (P20GM103499).) 的 INBRE 赠款的支持, 并资助 CA555536 & CA154664 从国家癌症研究所到 P.H.H。这一方案得到部分支持, 从霍华德休斯医学院通过大学预科 & 本科生科学教育项目, 并由国家研究资源中心 (5 P20 RR016461) 赠款。和国立卫生研究院 (8 P20 GM103499)。
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |