Vi beskriver en oprindelige transfer RNA analyse platform kaldet SPOt (strømlinet Platform for observere tRNA). SPOt samtidig foranstaltninger cellulære niveauer af alle tRNAer i biologiske prøver, i kun tre trin, og i mindre end 24 timer.
Overførsel RNA’er (tRNA) er rigelige kort ikke-kodende RNA arter, der er typisk 76-90 nukleotider i længde. tRNAer er direkte ansvarlige for proteinsyntese ved at oversætte kodon i mRNA i aminosyresekvenser. tRNAer blev længe betragtet som hus-holder molekyler, der manglede regulerende funktioner. En voksende mængde af beviser tyder imidlertid på, at cellulære tRNA niveauer svinger i korrespondance til varierende forhold som celletype, miljø og stress. Udsving i tRNA udtryk indvirker direkte gen oversættelse, favorisere eller undertrykke udtryk for bestemte proteiner. I sidste ende begribe dynamikken i proteinsyntesen kræver udvikling af metoder til at levere høj kvalitet tRNA profiler. Den metode, vi præsenterer her hedder SPOt, som står for strømlinet Platform for observere tRNA. Stedet består af tre trin starter med metaboliske mærkning af cellekulturer med radioaktivt orthofosfat, efterfulgt af guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform udvinding af radioaktivt samlede RNA’er og endelig hybridisering på in-house udskrives macroarrays. tRNA niveauer er anslået af kvantificere radioaktivitet intensitet på hver probe spot. I protokollen præsenteres her profil vi tRNAer i Mycobacterium smegmatis mc2155, en nonpathogenic bakterie ofte brugt som en model organisme for at studere tuberkulose.
Cellulære tRNA niveauer svinger betingelser som celletype, miljø og stress1,2,3. SPOt, strømlinet Platform for observere tRNA, er en original, pålidelig og enkel teknik, der giver mulighed for hurtig og præcis kvantificering af transfer RNA niveauer i laboratorie-dyrkede organismer.
tRNAer har bemærkelsesværdigt stabilt sekundære og tertiære strukturer4. De viser også talrige post-transcriptional ændringer5. Disse funktioner repræsenterer betydelige strukturelle og sekvens vejspærringer påvirke eller undertiden forhindrer direkte og reproducerbare tRNA profilering ved hjælp af standard benchmark RNA kvantificering teknikker6. Forskergrupper verden blev tvunget til at udvikle kreative, men ofte indviklede teknikker til at vurdere cellulære tRNA niveauer. Nogle af disse metoder omfatter: (1) to-dimensionelle elektroforetisk adskillelse af metabolisk mærket tRNAer kombineret med metodisk spot tildeling af nordlige skamplet1; (2) individuelle kvantificering af Northern duppes ved hjælp af omhyggeligt standardiseret radioaktive DNA-sonder7; (3) efter udvinding mærkning med cyanine fluorokromer efterfulgt af microarray analyse3, og (4) in vitro- stripning af tRNA ændringer ved hjælp af rekombinante demodification enzymer kombineret med reverse transkription og efterfølgende høj overførselshastighed sekventering8.
Stedet er en enkel og original kombination af to standard og ligetil tilgange: (1) RNA krop mærkning, der består i syntesen, i voksende organismer, radioaktive samlede RNA’er og (2) tRNA macroarrays, en systematisk og miniaturized genomisk værktøj optimeret til tRNA adskillelse.
Prøverne er strømlinet fra levende organismer til kvantificering platform. De analyseres direkte efter ekstraktion og behandlet ikke nogen yderligere, som væsentligt begrænser afvigelser i forhold til teknikker kræver efter udvinding forstærkning eller enzymatiske behandlinger. Stedet er alsidigt og nemt kan kombineres til polysome fraktionering at identificere og kvantificere tRNA delpopulationer, der er fysisk forbundet med at oversætte ribosomer.
Protokollen præsenteres her er optimeret til Mycobacterium smegmatis, og det var også med held anvendes til profil tRNAer i Escherichia coli–9, Saccharomyces cerevisiae10, mus og menneskelige cellekulturer11 .
Beta partikel emissioner er kendt bakteriehæmmende og bakteriedræbende stoffer14, men stråling i rækken testet har nogen væsentlig indflydelse på celle fitness. Scintillation tælle viste, at radioaktiviteten er indarbejdet i 25% af total-celle ekstrakter og efterfølgende, 1% af renset samlede RNA’er.
Sonder ens størrelser, sammenlignelige smeltepunktet og GC indhold, sammen med en ensartet protokol for macroarray spotting, hybridisering og kvantificering tillader objektiv måling af tRNA niveauer direkte fra spot signaler.
Stedet er reproducerbare og specifikke. Dens store dynamikområde og nemt justerbar tærskel giver mulighed for profilering lav rigelige arter, såsom tRNAer forbundet med polysomes, ved blot at forlænge array eksponering gange9. Efter den indledende investering for det nødvendige udstyr gennemsnit drift omkostninger pr. sample, herunder forbrugsvarer, $15 per prøver.
SPOt finder anvendelse på enhver organisme, hvis genom er tilgængelig for sonden design. Modelorganismer, der dyrkes in vitro- er ideelle kandidater til metaboliske mærkning. Som pattedyr genomer ofte indkode mange isodecoders (tRNAer, der deler samme anticodons men vises små forskelle i deres krop sekvenser) skal sonder være delvist degenererede at bevare homogene hybridisering af tæt tRNA arter. Endelig, vedhængende pattedyrceller give typisk lavere mængder af total RNA sammenlignet med organismer vokset i suspension som M. smegmatis, så kulturer skal skaleres betydeligt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af SC INBRE tilskud fra den nationale Institute General Medical Science – NIH (P20GM103499 til R.G.) og grants CA555536 og CA154664 fra National Cancer Institute til P.H.H. Dette program blev delvist understøttet af et stipendium til College of Charleston fra Howard Hughes Medical Institute gennem pre college & Undergraduate Science Education Program og tilskud fra det nationale Center for forskningsressourcer (5 P20 RR016461) og National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) fra de nationale kontorer i sundhed.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |