हम स्थान (मेटाबॉलिज्म tRNA के लिए सुव्यवस्थित प्लेटफ़ॉर्म) नामक एक मूल स्थानांतरण आरएनए विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म का वर्णन करते हैं. स्पॉट एक साथ केवल तीन चरणों में जैविक नमूनों में सभी tRNAs के सेलुलर स्तर, और 24 घंटे से कम समय में उपाय ।
स्थानांतरण RNAs (tRNA) प्रचुर मात्रा में कम गैर कोडिंग आरएनए प्रजातियों है कि आम तौर पर कर रहे है ७६ ९० न्यूक्लियोटाइड लंबाई में । tRNAs एमिनो एसिड अनुक्रम में mRNA में codons अनुवाद द्वारा प्रोटीन संश्लेषण के लिए सीधे जिंमेदार हैं । tRNAs लंबे समय से घर के रूप में विचार कर रहे थे अणुओं है कि विनियामक कार्यों का अभाव रखते हुए । हालांकि, सबूत के एक बढ़ती शरीर इंगित करता है कि सेलुलर tRNA स्तर जैसे सेल प्रकार, पर्यावरण, और तनाव के रूप में बदलती स्थितियों के लिए पत्राचार में उतार चढ़ाव । tRNA अभिव्यक्ति का उतार चढ़ाव सीधे जीन अनुवाद को प्रभावित करता है, एहसान या विशेष रूप से प्रोटीन की अभिव्यक्ति का दमन । अंततः प्रोटीन संश्लेषण के गतिशील समझने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले tRNA प्रोफाइल देने में सक्षम तरीकों के विकास की आवश्यकता है । विधि है कि हम यहां मौजूद नाम स्थान है, जो tRNA देख के लिए सुव्यवस्थित मंच के लिए खड़ा है । स्पॉट तीन रेडियोधर्मी orthophosphate के साथ कोशिका संस्कृतियों के लेबलिंग के साथ शुरू चरणों के होते हैं, रेडियोधर्मी कुल क्लोरोफॉर्म के guanidinium thiocyanate-phenol-RNAs निष्कर्षण द्वारा पीछा किया और अंत में संकरण पर मुद्रित घर macroarrays । tRNA स्तरों प्रत्येक जांच के मौके पर रेडियोधर्मिता तीव्रता को बढ़ाता द्वारा अनुमानित हैं । प्रोटोकॉल में यहां प्रस्तुत हम माइकोबैक्टीरियम smegmatis mc2१५५ में प्रोफ़ाइल tRNAs, एक रोगजनक जीवाणु अक्सर एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल के लिए तपेदिक का अध्ययन ।
सेलुलर tRNA स्तर सेल प्रकार, पर्यावरण, और तनाव1,2,3जैसे स्थितियों के अनुसार बदलेंगी । हाजिर, tRNA अवलोकन के लिए सुव्यवस्थित मंच, एक मूल, विश्वसनीय, और सरल तकनीक है कि प्रयोगशाला में स्थानांतरण आरएनए स्तरों के तेजी से और सटीक ठहराव-उगाया जीवों की अनुमति देता है.
tRNAs उल्लेखनीय स्थिर माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं4है । उंहोंने यह भी कई पोस्ट transcriptional संशोधन5प्रदर्शन । ये विशेषताएं महत्वपूर्ण संरचनात्मक और अनुक्रम बाधाओं पक्षपातपूर्ण या कभी-कभार मानक बेंचमार्क आरएनए ठहराव तकनीकों का उपयोग करते हुए प्रत्यक्ष और प्रतिलिपि tRNA को रोकने का प्रतिनिधित्व करती हैं6. दुनिया भर के अनुसंधान समूहों को रचनात्मक लेकिन अक्सर जटिल तकनीक सेलुलर tRNA स्तर का आकलन करने के लिए विकसित करने के लिए मजबूर किया गया । इन तरीकों में से कुछ में शामिल हैं: (1) चयापचयी लेबल tRNAs के दो आयामी electrophoretic जुदाई उत्तरी दाग1द्वारा व्यवस्थित स्थान असाइनमेंट के साथ संयुक्त; (2) उत्तरी ब्लाट द्वारा व्यक्तिगत ठहराव ध्यान मानकीकृत रेडियोधर्मी डीएनए जांच7का उपयोग; (3) के बाद cyanine fluorochromes के साथ निष्कर्षण लेबलिंग microarray विश्लेषण के द्वारा पीछा किया3, और (4) इन विट्रो tRNA संयोजक संशोधन रिवर्स प्रतिलेखन और बाद के साथ संयुक्त एंजाइमों का उपयोग संशोधनों के अलग करना उच्च-प्रवाह sequencing8।
स्पॉट दो मानक और सीधा दृष्टिकोण का एक सरल और मूल संयोजन है: (1) आरएनए बॉडी लेबलिंग, जो संश्लेषण में होते हैं, जीवों को उगाने में, रेडियोधर्मी कुल RNAs की और (2) tRNA macroarrays, एक व्यवस्थित और लघुकृत जीनोमिक उपकरण tRNA अलगाव के लिए अनुकूलित ।
नमूनों में रहने वाले जीवों से ठहराव प्लेटफार्म को सुव्यवस्थित कर रहे हैं. वे सीधे निष्कर्षण के बाद का विश्लेषण कर रहे है और किसी भी आगे जो काफी सीमा के बाद निष्कर्षण प्रवर्धन या एंजाइमी उपचार की आवश्यकता तकनीक की तुलना में पूर्वाग्रह सीमाएं सीमित नहीं है । स्पॉट बहुमुखी है और आसानी से polysome भिन्नीकरण करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है की पहचान करने और tRNA उपजनसंख्या कि शारीरिक रूप से ribosomes अनुवाद के साथ जुड़े रहे हैं यों तो ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम smegmatisके लिए अनुकूलित है, और यह भी सफलतापूर्वक ई कोलाई9, Saccharomyces cerevisiae10, माउस, और मानव कोशिका संस्कृतियों11 में प्रोफ़ाइल tRNAs के लिए इस्तेमाल किया गया था .
बीटा कण उत्सर्जन बैक्टीरियोस्टेटिक और जीवाणुनाशक एजेंटों14जाना जाता है, लेकिन परीक्षण रेंज में विकिरण सेल फिटनेस पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है । जुटाना गिनती से पता चला है कि रेडियोधर्मिता कुल के 25% में शामिल किया गया है-सेल निष्कर्षों और बाद में, शुद्ध कुल RNAs का 1%.
जांच ‘ समान आकार, पिघलने तापमान और GC सामग्री, macroarray खोलना के लिए एक समान प्रोटोकॉल के साथ तुलना, संकरण और ठहराव स्पॉट संकेतों से सीधे tRNA स्तर के निष्पक्ष माप के लिए अनुमति देता है ।
स्पॉट प्रतिलिपि व विशिष्ट आहे. इसकी बड़ी गतिशील रेंज और आसानी से समायोज्य दहलीज इस तरह के polysomes के साथ जुड़े tRNAs के रूप में कम प्रचुर मात्रा में प्रजातियों, की अनुमति देता है, बस सरणी जोखिम बार9लंबे समय तक । आवश्यक उपकरणों के लिए प्रारंभिक निवेश के बाद प्रति नमूना चलित लागत, उपभोग्य सामग्रियों सहित, औसत $१५ प्रति नमूने.
स्पॉट किसी भी जीव पर लागू होता है जिसका जीनोम जांच डिजाइन के लिए उपलब्ध है । मॉडल जीवों कि इन विट्रो में बड़े हो रहे हैं चयापचय लेबलिंग के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं. के रूप में स्तनधारी जीनोम अक्सर कई isodecoders सांकेतिक शब्दों में बदलना (tRNAs कि शेयर समान anticodons, लेकिन उनके शरीर के दृश्यों में छोटे मतभेदों को प्रदर्शित) जांच के लिए आंशिक रूप से बंद समरूप प्रजातियों के संकरण tRNA के संरक्षण के लिए पतित होने की जरूरत है । अंत में, अनुयाई स्तनधारी कोशिकाओं को आम तौर पर कुल आरएनए का कम मात्रा में ऐसे एम. smegmatisजैसे निलंबन में हो जीवों की तुलना में उपज है, तो संस्कृतियों को काफी पैमाने पर किया जाना चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंस-NIH (P20GM103499 to r) और पलाश CA555536 एंड CA154664 नेशनल कैंसर इंस्टिट्यूट से P.H.H. को एससी INBRE ग्रांट द्वारा सपोर्ट किया गया था इस कार्यक्रम के भाग में पूर्व के माध्यम से हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से चार्ल्सटन के कॉलेज के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था कॉलेज और स्नातक विज्ञान शिक्षा कार्यक्रम और राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन के लिए केंद्र से अनुदान द्वारा (5 P20 RR016461) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (8 P20 GM103499) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से ।
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |